بروتوكولات 3D بيوريتينغ من الجيلاتين ميثاكريلويل هيدروجيل القائم علي الحيوية
ديسمبر 21, 2019
العرض هنا هو طريقه لميثاكريلويل البيولوجية ثلاثية الابعاد من الجيلاتين.
جيلما هيدروجيل أساس bionics تصبح شعبية جدا في 3D الطباعة الحيوية. ومع ذلك، فإن اللزوجة المنخفضة تحد من إمكانية طباعتها. هنا نحن نشارك استراتيجيات لطباعة GelMA في مختبرنا مع باحثين آخرين.
في هذا الفيديو نستخدم بشكل كامل الخصائص الخاصة لهذه المواد الحيوية ونقترح عدة طرق طباعة للهياكل ثلاثية الأبعاد المختلفة التي يمكن أن تسهم في المزيد من التطبيقات الطبية الحيوية. لاتخاذ تلف الجهاز على سبيل المثال الآثار المحتملة لاستخدامها في العلاج المقابل عن طريق حقن تضمين أو تتبع هياكل جيلما المطبوعة. لن يكون من السهل حل غيلما المجفف بالتجميد في وقت قصير.
لتسريع عملية حل يمكن استخدام خلاط دوامة. كل مادة حيوية سوف تستخدم خصائص خاصة الحميمة من GelMA. اقترحت chemer جديدة يجب أن تأخذ بشكل صحيح تجول ما هو تكييف الحرجة عند الطباعة.
تحدد تفاصيل العملية نجاح إجراءات الطباعة. ولهذا السبب نختار عرضًا مرئيًا لمشاركته مع باحثين آخرين. لتلفيق microspheres تبدأ من خلال ربط اثنين من أقطاب حلقة معدنية مع أعمدة الأرض وإيجابية.
ضع اللوحة المعدنية المتصلة بالجهد العالي أسفل قطب الحلقة وطبق بيتري مع زيت السيليكون على اللوحة المعدنية كجهاز استقبال قطرة. إعداد الحبر الحيوي عن طريق حل تجميد المجففة جيلما وLLA وDPBS تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر للعقم ثم تسخينه في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. فصل خلايا MDA-MB-231 مع ثلاثة ملليلترات من 0.25 في المئة التربسين و 0.02 في المئة EDTA حل لمدة ثلاث دقائق في 37 درجة مئوية.
نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي لهم في 100 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant وخلط الخلايا مع ملليلتر واحد من الحبر الحيوي المعدة ببطء الأنابيب صعودا وهبوطا مع التأكد من تجنب فقاعات الهواء. استلهم مليلتر واحد من خليط الحبر الحيوي وخلية إلى حقنة معقمة ثلاثة ملليلتر.
تغذية الحبر الحيوي من قوة الهواء المضغوط ووضع الحقنة على لاعبا اساسيا. التبديل على قوة الجهد العالي وتعيين الجهد كما صفر إلى أربعة كيلوفولت. في وقت واحد بدوره على ضوء 405 نانومتر الطول الموجي لربط عبر قطرات جيلما في خمسة ملليلتر من زيت السيليكون.
decant طبق بيتري للتخلص من معظم زيت السيليكون واستخدام ملعقة لنقل النفط وmicrospheres المتبقية في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. إضافة خمسة ملليلتر من DPBS وهز الخليط الطرد المركزي الأنبوب في 100 مرة G وإزالة نابيرانت. نقل microspheres في طبق بيتري مع DMEM والثقافة لهم في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام.
بعد ثلاثة أيام تجاهل المتوسطة وغسل microspheres مع DPBS. إصلاحها مع ملليلتر اثنين من أربعة في المئة PFA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم تجاهل PFA وتكرار الغسيل. Permeabilize الخلايا مع ملليلترين من 0.5 في المئة السطح غير الأيونية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة تجاهل السطحي وغسل microspheres مع DPBS.
وصمة عار المقبل الخلايا مع TRITC-phalloidin لمدة 30 دقيقة ثم DAPI لمدة 10 دقائق في الظلام التخلص من الأصباغ وغسل المجالات مع DPBS بعد كل تلطيخ. صورة microspheres مع المجهر الفلورية confocal. قم بذوبان مسحوق الصوديوم المعقم في الماء الأيوني بنسبة وزن 2 في المئة إلى الحجم.
إعداد حل معقمة الحبر الحيوي كما وصف سابقا ثم تسخين الحبر الحيوي والصوديوم alginate في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. التربسينيزي والطرد المركزي bMSCs وفقا للإجراء الموصوف سابقا ل MDA-ميغابايت 231 الخلايا ثم إزالة السائل فوق الطاقة وإعادة بيليه الخلية مع 2 ملليلتر من الحبر الحيوي GelMA. استلهم مليلترين من خليط خلايا الحبر الحيوي إلى حقنة 10 ملليلتر ومليلترين من خليط ألجينات الصوديوم إلى حقنة أخرى.
تغذية الحلول مع اثنين من حقنة مضخات الحبر الحيوي في 50 ميكرومتر في الدقيقة الواحدة و alginate الصوديوم في 350 ميكرومتر في الدقيقة الواحدة. بدوره على ضوء الطول الموجي نانومتر 405 لتشعيع أنبوب شفاف وعبر ربط ألياف جيلما. استخدم طبق بيتري لاستلام الألياف وجمعها بملعقة.
نقل الألياف إلى طبق مع DMEM/F12 وثقافتها لمدة ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون. بعد زراعة الخلايا اتبع التوجيهات الموصوفة سابقا لمراقبة الألياف تحت مجهر الفلورانس confocal. قم بحل صبغة الجافة وLA وDPBS وأضف صبغة أرجوانية صالحة للأكل في الحل لتحسين دقة الطباعة.
تصفية الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر للعقم وتسخينه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بناء نماذج 3D مع برنامج كندي واستيراد وثائق النموذج إلى البرنامج العلوي من الطباعة الحيوية DLP التطبيقية. إضافة عشرة ملليلترات من الحبر الحيوي المعدة إلى الحوض الصغير للطبعة الحيوية.
تعيين معلمات الطباعة وفقا لاتجاهات المخطوطة ثم بدء الطباعة. عندما تكتمل إزالة الهيكل المطبوع من الطابعة الحيوية وتزج في DPBS في طبق بيتري. فصل بيليه MDA-MB 231 الخلايا كما هو موضح سابقا.
resuspend لهم مليلتر اثنين من DMEM وإضافة تعليق إلى هيكل المطبوعة. زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام ثم إعداد الهياكل للمراقبة مع المجهر الفلوري confocal كما وصف سابقا. إعداد 10 في المئة من الوزن لحجم GelMA و 0.5 في المئة الوزن لحجم حل LAP ثم تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
تعقيم مسحوق الجيلاتين تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة وإضافته إلى حل جلما LAP بنسبة وزن بنسبة خمسة بالمائة إلى الحجم. سخني الخليط في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ملء القوالب مع الحبر الحيوي المعدة ووضعها في ثلاجة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
استخدام شفرة لإزالة صحائف هيدروجيل عبر جزئيا من القوالب. الجمع بين 2D أوراق هيدروجيل مصبوب والسندات لهم مع GelMA عن طريق تشعيع في 405 نانومتر لمدة دقيقة واحدة. فصل و بيليه HUVECs خلط الخلايا مع مليلتر اثنين من DMEM وحقن التعليق في microchannel مع فوهة وحقنة.
للساعات الثلاث المقبلة الوجه رقاقة رأسا على عقب كل 15 دقيقة لتحقيق موحدة وكاملة مقاعد الخلية. ثقافة رقائق في طبق بيتري لمدة ثلاثة أيام في DMEM في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون ثم إعدادها للمراقبة المورفولوجية. عندما سقطت قطرات GelMA في زيت السيليكون المتلقي احتفظوا بشكل كروي قياسي بدون ذيول.
حافظت الخلايا المغلفة التي تعاني من قوة حقل الجهد الكهربائي عالية قدرتها على الانتشار التي تحققت من التوافق الحيوي لطريقة التصنيع الكهربائية المدعومة. تم اختيار طابعة DLP الحيوية لتصنيع هياكل GelMA مع أشكال أكثر تعقيدا مثل الأذن الأنف وغرفة متعددة. HUVECs المصنفة تعلق على المواد GelMA وانتشرت على سطح هياكل جيلما المترابطة مما يدل على أن هذا التطبيق يحمل إمكانات لهندسة الأنسجة.
تم استخدام استراتيجية ربط مرتين لتلفيق رقائق microfluidic تستند GelMA. تم بناء رقائق مع مختلف microchannels من خلال تصميم قوالب مختلفة على الطلب و HUVECs كانت مبذرة في القنوات وتعلق على جدار القناة تشكيل شكل السفينة العيانية. يتم تطبيق مصدر الجهد العالي عند تصنيع microspheres.
يجب على الباحثين فحص الدوائر من قبل وعدم لمس المليبارات المكشوفة التي تحمي المشغلين أو يجعل الخلايا من الضرر الناجم عن الدائرة القصيرة. يمكن أن تكون قاعدة المياه بالموجات فوق الصوتية خيار آخر لتسريع السرعة المستحقة. بالتأكيد هذه المساهمة لخصت طرق الطباعة الحيوية 3D من جيلما في مختبرنا.
يمكن للباحثين الرجوع إلى الفيديو وتحسين أو توسيع استراتيجيات الطباعة لتلبية المزيد من المتطلبات الطبية الحيوية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA). وتناقش استراتيجيات لتعزيز قابلية طباعة GelMA، وهو أمر بالغ الأهمية لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد
- المواد الحيوية
- الهندسة الطبية الحيوية
خلفية علمية
- تكتسب الهيدروجيلات المكونة من GelMA شعبية متزايدة في الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.
- تحد اللزوجة المنخفضة لـ GelMA من قابليته للطباعة.
- هناك حاجة إلى استراتيجيات لتحسين تطبيقاته في المجالات الطبية الحيوية.
- تشمل التطبيقات المحتملة علاج تلف الأعضاء.
الغرض من الدراسة
- مشاركة استراتيجيات طباعة فعالة لـ GelMA.
- استكشاف الخصائص المميزة لـ GelMA في مختلف الهياكل ثلاثية الأبعاد.
- المساهمة في تطوير التطبيقات الطبية الحيوية.
الطرق المستخدمة
- الاستفادة من الخصائص الفريدة لمادة GelMA.
- تطوير طرق طباعة متنوعة.
- استراتيجيات تضمين أو تتبع الهياكل المطبوعة.
- معالجة التحديات المتعلقة بإذابة مادة GelMA المجففة بالتجميد.
النتائج الرئيسية
- توضيح تقنيات الطباعة الفعالة لـ GelMA.
- عرض التطبيقات المحتملة في العلاج.
- تحديد التحديات المتعلقة بإذابة GelMA.
- تقديم رؤى من أجل المزيد من الأبحاث في مجال الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.
الاستنتاجات
- يمكن أن تؤدي الطرق المحسنة للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لـ GelMA إلى تعزيز التطبيقات الطبية الحيوية.
- هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لتحسين قابلية طباعة GelMA.
- إمكانية تقديم مساهمات كبيرة في علاج الأعضاء.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لهيدروجيلات GelMA تصنيع هياكل معقدة محملة بالخلايا لتطبيقات هندسة الأنسجة والطب التجديدي. يتناول هذا البروتوكول تحديات القابلية للطباعة من خلال تكوين القطيرات بمساعدة الكهرباء، وبثق الألياف، والنمذجة القائمة على تقنية DLP، مما يدعم التصنيع القابل للتكرار للكرات المجهرية والألياف والرقائق الموائعية الدقيقة. تعزز هذه الطرق من الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية من خلال توفير سقالات متوافقة حيوياً وقابلة للضبط تحاكي إشارات المصفوفة خارج الخلية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء التفاعلات بين الخلايا والمصفوفة من خلال أنماط RGD والأنماط الحساسة لـ MMP في GelMA، مما يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف العلاجية.
- القيمة التشغيلية: توفر تنسيقات قياسية من الكريات الدقيقة والألياف للفحص عالي الإنتاجية لسلوك الخلايا تحت إشارات فيزيائية حيوية محكومة.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد بيئات دقيقة ثلاثية الأبعاد قابلة للقياس لتقييم انتشار الخلايا، وحيويتها، وتشكيلها النسيجي استجابةً للاضطرابات الدوائية أو الجينية.
- القيمة التشغيلية: دعم توحيد المقايسات من خلال تركيبات GelMA القابلة للربط التشابكي بالأشعة فوق البنفسجية مع صلابة ومعدلات تحلل قابلة للضبط.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يسهل تصنيع رقاقات مائعية دقيقة قابلة للتروية ومبطنة بخلايا HUVECs، مما يتيح إنشاء نماذج أنسجة وعائية لدراسات نقل الأدوية والسمية.
- القيمة التشغيلية: يتيح الإنتاج القابل للتوسع لبنيات ثلاثية الأبعاد معقدة (على سبيل المثال: الأنف، الأذن، أو متعددة الغرف) للتحقق قبل السريري من العلاجات التجديدية.
تكامل مسارات العمل ومنظومة التشغيل
يتم دمج سير العمل لتحضير الحبر الحيوي، وتغليف الخلايا، والربط التشابكي بمساعدة الجهد الكهربائي أو الضوء لإنتاج تركيبات هيدروجيل وظيفية مناسبة للتقييم البيولوجي اللاحق.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالالتصاق بوساطة الإنتغرين وإعادة التشكيل المعتمدة على البروتياز في سياقات ثلاثية الأبعاد.
- المسح: تتيح تصنيعاً قابلاً للتكرار للكرات المجهرية والألياف من الهيدروجيل لإجراء مسح معياري للمركبات في مصفوفات ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجية.
- التحليلات: توفر قراءات هيكلية وفلورية (مثل التصوير البؤري لـ actin والنوى) لقياس الاستجابات الخلوية عبر الظروف التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تجسر الفجوة بين الاكتشاف والعمل قبل السريري من خلال إنشاء شرائح مائعية مجهرية وعائية تماثل تكوين ووظيفة الأوعية الدموية المجهرية البشرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة نموذجية قابلة للتكيف مع مختلف أنواع الخلايا والأشكال الهندسية، مما يقلل من جهد إعادة التطوير عبر المشاريع.
الأثر التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز التحقق من الهدف من خلال تمكين التقييم الوظيفي للخلايا في هيدروجيلات لاصقة وقابلة للتحلل تحاكي السمات الرئيسية للبيئة الدقيقة.
- القيمة التشغيلية: تحسين إمكانية تكرار النتائج من خلال توحيد تركيب الحبر الحيوي، والترشيح العقيم، ومعايير الربط التشابكي المنضبطة.
- القيمة الاستراتيجية: تقليل الجداول الزمنية للحد من المخاطر البيولوجية من خلال توفير نماذج تنبؤية في مراحل مبكرة لاندماج الأنسجة وتكوين الأوعية الدموية.
- تأثير المحفظة: دعم قرارات المتابعة أو التوقف في برامج الطب التجديدي من خلال تمكين التكرار السريع لتصاميم السقالات وتفاعلات الخلايا مع المواد.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في كيمياء الهيدروجيل، وتحضير الحبر الحيوي المعقم، وأنظمة الربط التشابكي الكهربائية أو الضوئية.
- يستلزم توفر أجهزة تشمل مصادر طاقة ذات جهد عالٍ، ومضخات حقن، ومصادر ضوء بطول موجي 405 nm، وطابعات حيوية تعمل بتقنية DLP.
- يتطلب توحيداً قياسياً بين الفرق البحثية فيما يخص لزوجة الحبر الحيوي، وكثافة الخلايا، ومدة الربط التشابكي لضمان قابلية تكرار النتائج بين المختبرات.
- يتضمن اعتبارات الموائمة لأنواع الخلايا المختلفة (مثل MDA-MB-231 وbMSCs وHUVECs) وحركية الهلام عبر تركيزات GelMA المختلفة.
- يتضمن قيوداً عملية مثل اللزوجة المنخفضة لـ GelMA، مما يستوجب استخدام طرق مساعدة (مثل الطباعة الكهروديناميكية المائية، أو البثق المشترك للألجينات) للحفاظ على دقة الشكل.
