طريقه إخراج عاليه لعزل Pericytes الدماغي من الماوس

في الآونة الأخيرة ، أصبح دور pericytes الدماغي واضحة في الاضطرابات العصبية ووظائف الدماغ. لذلك، تطوير طريقة موثوقة للثقافة لهذه الخلايا أمر حتمي. بروتوكولنا لاستخراج البيريكس الدماغي مورين يمثل أداة موثوقة للدراسات في المختبر وتوفير pericytes مع نقاء عالية وغلة الخلية.

إظهار الإجراء مع أنوبريا ميهرا ستكون لوسي ديهوك، فني من مختبري. تبدأ من خلال وضع الدماغ من محدد خالية من مسببات الأمراض أربعة إلى ستة أسابيع الذكور C57BL/ 6 الماوس على ممسحة عقيمة خالية من الوبر الجافة واستخدام ملقط طرف المنحني لإزالة المخيخ، والمخطط والأحزاب القذالي. استخدام مسحة القطن لإزالة جميع السحائيات مرئية وتحويل أنسجة الدماغ رأسا على عقب.

افتح الفصوص بسكتات خارجية فاتحة وأزل جميع الأوعية الدموية المرئية. ثم ضع أنسجة الدماغ الخالية من السحايا في طبق بيتري من عيار 100 ملليمتر يحتوي على 15 ملليلترًا من عازل الغسيل البارد B.To تجانس الأنسجة ، ونقل عينة الدماغ إلى أنبوب هاون طاحونة أنسجة دونسي وإضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلترات من الغسيل العازل B إلى الأنبوب. استخدام آفة فضفاضة ل mince الأنسجة 55 مرة، ثم شطف الآفات مع غسل العازلة B والملاط المفروم الأنسجة مع الأوبئة ضيق 25 مرة.

في نهاية التجانس، aliquot بالتساوي الطين بين اثنين من أنابيب 50 ملليلتر وإضافة 1.5 مرة حجم الباردة 30٪ الأبقار المصل الألبومين dextran. ثم يهز بقوة الأنابيب لخلط الطين. لعزل الكسر الوعائي، تترسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي ونقل المناذرات إلى أنبوبين جديدين.

تخزين بيليه في غسل العازلة B على الجليد. Resuspend الكريات في ثلاثة ملليلتر من الغسيل البارد العازلة B على الجليد. أجهزة الطرد المركزي احصاء ااوسانت وتكرر هذه الخطوة مزيد من مرة واحدة.

تجاهل supernatants و resuspend الكريات في ثلاثة ملليلتر من الغسيل العازلة B.Then تجمع الكريات resuspended وجلب الحجم النهائي لتعليق الخلايا المجمعة إلى 10 ملليلتر مع عازلة الغسيل الباردة الطازجة B.أبعد تفكيك الخلايا مع ماصة 10 ملليمتر ست مرات حتى لا توجد كتل المتبقية من الكريات مرئية واستخدام تجميع مرشح فراغ ومصفاة شبكة النايلون لتصفية تعليق الخلية. وضع المصفاة في طبق بيتري ومسح شبكة مع الغسيل العازلة الطازجة B وكشط لاسترداد أي الشعيرات الدموية. ثم قم بإجراء ترشيح ثانٍ مع فلتر جديد.

تقسيم الترشيح بالتساوي بين أنبوبين وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من المابس، تجمع الكريات في أنبوب واحد يحتوي على الغسيل العازلة قبل الدفء B مع الإنزيمات وإضافة كولاجيناز مسبقًا / Dispase إلى الأنبوب. وضع أنبوب في حوض مياه الطاولة يهز لدقائق 33 دقيقة بالضبط في 37 درجة مئوية قبل وقف التفاعل مع 30 ملليلتر من الغسيل البارد العازلة B.Collect الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتجاهل بعناية عظمى.

بسرعة ولكن بعناية إعادة بيليه في غسل العازلة B ست مرات والطرد المركزي التعليق مرة أخرى. بعد التخلص من supernatant، resuspend بيليه في 18 ملليلتر من نصفية كاملة DMEM وبذر مليلتر من تعليق الخلية في DMEM كاملة في تسعة آبار من ثلاثة ماتريجل المغلفة ستة آبار. وضع الثقافات الخلية في معقم 37 درجة مئوية 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة قبل إزالة بعناية الحطام من كل بئر وإضافة وسائل الاعلام DMEM الطازجة.

بعد 48 ساعة، قم بتغيير الوسط في كل بئر كل 48 ساعة. في اليوم الثامن إلى العاشر عندما تصل الخلايا إلى 100٪ التقاء, مرور الخلايا في ثقافة pericyte المتوسطة على الجيلاتين جديدة مغلفة ستة آبار لوحات والعودة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ستة إلى سبعة أيام إضافية مع الرصد. ثم تقسيم الخلايا مرة أخرى في اليوم 17 في متوسطة pericyte إلى لوحات الجيلاتين المغلفة الجديدة.

من مرور صفر إلى مرور اثنين، وهناك خصائص المورفولوجية المحددة التي يمكن من خلالها تحديد الخلايا البطانية والزيادة التدريجية اللاحقة في pericytes. في ثقافة مرور صفر ، والخلايا البطانية ممدود النامية من microvessels هي في وفرة. قلّت هذا وفرة بعد ممر واحدة وتغيّب بعد مرور اثنان.

على العكس من ذلك، تظهر pericytes كخلايا رباعية نادرة في الثقافات المبكرة وتصبح وفيرة من خلال مرور اثنين. تقييم التعبير عن NG2، CD146، و PDGFR بيتا يمكن استخدامها لتقييم نقاء ثقافة بيريكيت بواسطة الكمى PCR، وpcytochemistry، ولطخة الغربية. إن عملية الهضم هي خطوة حاسمة لنجاح البروتوكول.

تأكد من مراقبة تركيزات الإنزيم ووقت الحضانة بدقة.