توليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية الخاضعة للرقابة لدراسة السلوك الميكروبي

هذه الطريقة تسمح لتوضيح البيئة الدقيقة والسلوك من الكائنات الحية الدقيقة التنقل التدرجات الكيميائية الحيوية والكشف عن المقايضات الخفية، وديناميات المغذيات، والسكان في البيئة الدقيقة ذات الصلة بيئيا. من خلال الجمع بين تكنولوجيا microfluidic مع التحليل الضوئي ، ونحن توليد نبضات كيميائية تسيطر عليها ، حيث المترجمة الكيماوية تصبح متاحة فجأة في microscale ، لقياس الاستجابة الكيميائية من السكان الميكروبية تتعرض لأول مرة إلى التدرجات الكيميائية غير اكيد. صمم القناة باستخدام برنامج CAD، واطبعه على فيلم شفافية لإنشاء قناع الصورة.

تلفيق السيد عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة في غرفة نظيفة، وفقا للمخطوطة. إعداد خليط PDMS عن طريق الجمع بين الداسترومر مع وكيل علاجها بنسبة 10 إلى واحد في منقار 40 ملليلتر. مع سكين بلاستيكية، اخلط بقوة حتى يصبح السائل متجانساً.

على الفور degas خليط PDMS في غرفة فراغ لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتسريع العملية، الإفراج دوريا الفراغ من أجل انفجار الفقاعات التي تشكل في واجهة. إزالة الغبار من سطح سيد مع منظف مضغوط.

ثم صب خليط PDMS دياسيد على سيد، وخبز في فرن في 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. قطع PDMS مع شفرة حول microstructures على مسافة قدرها حوالي خمسة ملليمترات، ومن ثم بعناية قشر PDMS من سيد. ثقوب لكمة لتكون بمثابة مدخل ومنفذ من القنوات الدقيقة.

ختم microchannel مع شريط لاصق لمنع تراكم الغبار. صمم الشكل ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج التصميم ثلاثي الأبعاد، وطبعة المفتاح لقالب PDMS مع طابعة ثلاثية الأبعاد عالية الدقة. بعد إعداد و degassing خليط PDMS كما فعلت سابقا، وتنظيف سطح سيد عن طريق dabbing مع شريط لاصق.

ضع السيد على مقياس ثم، في حين تجنب المنطقة الوسطى من سيد، صب 23.4 غراما من خليط PDMS uncured من أجل الحصول على الارتفاع المطلوب من PDMS عن طريق مطابقة ارتفاع سيد في 0.5 ملليمتر. إزالة أي فقاعات المتبقية مع مساعدة من الهواء المضغوط.

وضع المدلى بها PDMS على سيد في فرن في 45 درجة مئوية لخبز لمدة 12 ساعة على الأقل. ثم، بلطف قشر قبالة طبقة PDMS تصلب، ومدخل لكمة وثقوب منفذ لحقن التعليق البكتيري. قم بتنشيط كل من سطح طبق بيتري وطبقة PDMS مع بلازما الأكسجين لمدة دقيقتين.

السندات قالب PDMS على طبق بيتري عن طريق الضغط بلطف على القالب إلى طبق بيتري. تجنب الضغط على مكان وجود الميزات. ضع طبق بيتري المستعبدين إلى قالب 3D PDMS في فرن في 45 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل لتعزيز السندات الكيميائية.

بعد ذلك، قم بتنشيط غشاء البولي المسامي النانوي في غرفة بلازما الأكسجين لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية، وتمييع حل تجاري من 3-aminopropyltriethoxysilane في المياه ديونيد إلى 1٪ من قبل حجم باستخدام أنبوب البولي بروبلين. نقل المخفف 3-aminopropyltriethoxysilane حل في طبق بيتري, وتزج الغشاء المنشط في حل 3-aminopropyltltthoxysilane لمدة 20 دقيقة.

ثم, إزالة الغشاء من حل 3-aminopropyltriethoxysilane مع ملاقط, ووضعها على غرفة نظيفة مسح لتجف. لتصنيع قنوات PDMS microfluidic التي ستقع على الغشاء وتسمح بغسل الساحة البكتيرية ، كرر تصنيع الجهاز microfluidic لتجربة النبض الكيميائي واحد كما كان عليه في السابق. لسندات قنوات الغسيل PDMS إلى الغشاء الوظيفي، أولا تنشيط كل من قناة غسل PDMS والغشاء البولي مع غرفة بلازما الأكسجين لمدة دقيقتين.

مباشرة بعد العلاج البلازما، وجلب الغشاء وظيفية وقناة غسل PDMS في اتصال عن طريق الضغط بلطف على قناة غسل PDMS على الغشاء. من المهم أن تضغط بلطف معا PDMS والغشاء، أو قد يكون الغشاء لا رجعة فيه المستعبدين إلى سقف 200 ميكرومتر ارتفاع PDMS microchannel. ثم، وتفعيل كل من الاستعبادي صفح PDMS غسل قناة الغشاء البولي و 3D PDMS العفن المستعبدين سابقا إلى طبق بيتري عن طريق وضعها في غرفة البلازما الأكسجين لمدة دقيقتين.

شطيرة الغشاء بين طبقتين من طبقات PDMS، واضغط معا. ضع طبق بيتري المستعبدين إلى هيكل الساندويتش في فرن في 45 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل لتعزيز السندات الكيميائية. للبدء، والحفاظ على غرفة ميليفلورويديك تحت فراغ لمدة 20 دقيقة.

ثم، ضع طبق بيتري الذي يحتوي على غرفة المليفلوريميك على مرحلة المجهر. مع ماصة، ملء الغرفة تحت الغشاء مع تعليق البكتيرية المخفف من GFP-fluorescent فيبريو ordalii في واحد ملليمولار 4-ميثوكسي-7-النيترويندولينيل-قفص-إل-جلوتاميت حل في مياه البحر الاصطناعية. بعد ملء القناة مع تعليق البكتيرية، وامتصاص حل في الزائدة مع منشفة ورقية، وختم مدخل ومنافذ مع المقابس PDMS عن طريق الضغط بلطف لهم في الثقوب.

ملء حقنة مع محلول مياه البحر الاصطناعية من واحد ملليمولار 4-ميثوكسي-7-النيترويندولينيل-قفص-L-الغلوتامات، وإرفاق أنابيب إلى مدخل ومأخذ قناة الغسيل فوق الغشاء. قم بتوصيل الأنابيب بخزان للنفايات، وتأكد من أن الأنبوب مغمور بالكامل في خزان نفايات السوائل لتجنب تذبذبات الضغط. تعيين معدل التدفق على مضخة حقنة إلى 50 ميكرولتررس في الدقيقة الواحدة.

بدء ضخ حقنة لتحديد تدفق في قناة الغسيل فوق الغشاء. بدء تشغيل البرنامج التحكم في شعاع LED ومرحلة المجهر، وتوليد تسلسلات محددة من قبل المستخدم من البقول في مواقع مختلفة ومع كثافة مختلفة. تسجيل الفيديو باستخدام هدف 4x في فترات زمنية منتظمة على مدى فترة عدة ساعات وعلى عدة مواقع متجاورة لتغطية سطح كبير.

في هذه الدراسة، تم استخدام الأجهزة microfluidic و مللي فلوريد لدراسة الاستجابة الكيميائية البكتيرية وتراكم ملامح في ظل ظروف المغذيات الحيوية. وتظهر الإسقاطات الحد الأقصى للكثافة الوضع البكتيري، المشار إليه بالآثار البيضاء، على مدى فاصل زمني 0.5 ثانية مباشرة بعد إطلاق النبضة و40 ثانية بعد إطلاق النبض. كما تم عرض المسارات البكتيرية باللون الأسود بعد 60 ثانية من إطلاق النبض.

وتمثل المنطقة المظللة النبض الكيميائي الذي يطلقه التحليل الضوئي في الوقت صفر ثانية في منتصف مجال الرؤية، الذي انتشر فيما بعد. يتم هنا عرض تركيز البكتيريا، وكذلك الديناميات الزمنية لسرعة الانجراف شعاعي بعد إطلاق نبض في وسط مجال الرؤية. القيم السلبية للسرعة الانجراف تتوافق مع الحركة الكيماوية الموجهة نحو مركز النبض.

يتم تقديم إحصاءات السباحة هنا للسكان البكتيرية في غياب التدرجات الكيميائية. تمثل المسارات الإسقاطات ثنائية الأبعاد للحركة البكتيرية ثلاثية الأبعاد في القناة الدقيقة. وكان توزيع احتمال سرعة السباحة البكتيرية المقاسة مناسباً من خلال توزيع غاما.

من المسارات البكتيرية، تم استخراج التوزيع الاحتمالي للوقت بين إعادة التوجيه المتتالية. وقد استخدم نمط إعادة التوجيه، وتوزيع سرعة السباحة، وإحصاءات إعادة التوجيه للكائنات الحية في إثراء نموذج قائم على الفرد. وقد تم اختبار هذه الطريقة على البكتيريا البحرية فيبريو ordalii أداء chemotaxis نحو الغلوتامات الأحماض الأمينية، ولكن المنهجية المقترحة تنطبق على نطاق واسع على مجموعة مختلفة من الأنواع وكيماوياتtractants، وكذلك للعمليات البيولوجية وراء chemotaxis، مثل السكان وديناميات المجتمع في ظروف غير متجانسة مكانيا وديناميكية.

وقد تجاهلت التقنيات الكلاسيكية في علم البيئة الميكروبية وعلم الأحياء الدقيقة، مثل النمو في الثقافات الدفعية أو الثقافات، إلى حد كبير الخصائص الملعقة الزمنية للموائل الميكروبية. ويهدف الخلق شبه الفوري للبقوليات الكيميائية في النطاقات الدقيقة عن طريق التحليل الضوئي إلى إعادة إنتاج نوع البقول الغذائية التي تواجهها البكتيريا البحرية في البرية من مجموعة من المصادر، على سبيل المثال، الانتشار المنتشر للأعمدة خلف الجسيمات العضوية الغارقة أو المغذيات المنتشرة من خلايا العوالق النباتية المتحللة. حل أمينوسيلان هو سامة بشكل حاد وينبغي التعامل معها بعناية فائقة.

نحن نعمل حصرا تحت غطاء محرك الدخان وارتداء معدات واقية مثل معطف المختبر، نظارات السلامة، والقفازات. كما أننا نهتم بالنفايات التي ولدناها.