اختبار توافق الدم من زرع الدم الاتصال في نموذج حلقة تدفق محاكاة تدفق الدم البشري
March 5th, 2020
يصف هذا البروتوكول تقييمًا شاملًا للتوافق المنقم لأجهزة ملامسة الدم باستخدام غرسات الأعصاب الوعائية المقطوعة بالليزر. يتم تطبيق نموذج حلقة التدفق مع الدم البشري الطازج ة المندفعة لمحاكاة تدفق الدم. بعد التروية ، يتم تحليل مختلف علامات الدم ومقارنتها بالقيم المكتسبة مباشرة بعد جمع الدم لتقييم توافق الخلايا الدموية للأجهزة المختبرة.
يقدم هذا البروتوكول نموذجًا للتحقيق في قابلية الهيموفيوتيا لأجهزة الاتصال بالدم وفقًا لإرشادات المنظمة الدولية للمعايير. النموذج مثالي لمحاكاة الظروف الفسيولوجية التي تتوافق مع الزرع منذ الخلفية المنخفضة للأحداث الخثارية والتركيز المنخفض من مضادات التخثر تمكين تحليل واسع لمعلمة الدم. هذه الطريقة مثالية للبحوث الحيوية لأنها توفر طريقة بسيطة لتقييم القدرة على الهيموفياتي.
وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامه للدراسات قبل الكلينيكية. لتحميل الهيبارين، أول مزيج 5،000 وحدة دولية من الهيبارين غير مخفف مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم للحصول على 15 وحدة دولية لكل ملليلتر من تركيز الهيبارين. بعد ذلك، أضف 900 ميكروليتر من محلول الهيبارين المخفف إلى ثلاثة أحاديات محايدة وثلاثة أحاديات محفوظة لكل متبرع وتخزين أحاديات الهبارين المحملة بأربع درجات مئوية.
قبل 30 دقيقة من جمع عينة الدم، ضع الـ monovettes في درجة حرارة الغرفة. عندما تكون أحادية الحرارة، وجمع تسعة ملليلتر من الدم في كل من ثلاثة monovettes لكل متبرع قبل تجميع جميع 27 ملليلتر من الدم من كل متبرع في حاوية بلاستيكية واحدة. لإعداد حلقة التدفق، قم بتحميل أنبوب واحد على الأقل لكل حالة مع زرع الليزر العصبي الوعائي من الفائدة ووضع نهاية واحدة لكل أنبوب في خزان مملوء بـ 0.9٪ من كلوريد الصوديوم.
ضع أنبوبًا فارغًا في الخزان وربط جميع الأنابيب برأس المضخة. ثم أدخل الطرف الآخر من كل أنبوب في اسطوانة قياس وضبط إعدادات مضخة الغمر إلى معدل تدفق 150 ملليلتر في الدقيقة الواحدة باستخدام جهاز توقيت أثناء التحقق من مستوى التعبئة في اسطوانة القياس. لاختبار القدرة على الهيمواكية، استخدم حقنة 12 ملليلتر لملء كل أنبوب بستة ملليلترات من الدم.
بعد تشكيل دائرة، استخدم 0.5 سنتيمتر طول من السيليكون ربط أنابيب لإغلاق الأنابيب بإحكام ووضع الأنابيب في حمام الماء 37 درجة مئوية. ثم ابدأ الأنبوب لمدة 60 دقيقة. لتحليل تعداد الدم كله، إضافة 1.2 ملليلتر من الدم غير المشبع أو 1.2 ملليلتر من الدم من كل أنبوب بعد التسريب في أحادية الفردية التي تحتوي على EDTA.
عكس بعناية monovettes خمس مرات وتحميل قوارير في محلل الدم لتحليل تعداد الدم لكل عينة. في نهاية التحليل، ضع أحاديات على الجليد لمدة 15-60 دقيقة. لجمع البلازما سيترات، ملء أحاديات تحتوي على سترات مع 1.4 ملليلتر من الدم غير الم pered أو pered وعكس بعناية كل مونوفيت خمس مرات.
فصل البلازما عن طريق الطرد المركزي ونقل ثلاثة 250 ميكرولتر aliquots من جزء البلازما في الفردية 1.5 ملليلتر ردود الفعل أنابيب. ثم تجميد عينات البلازما في النيتروجين السائل وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية حتى تحليلها. لجمع البلازما EDTA، بعد الحضانة أربع درجات مئوية بعد قياس تعداد الدم، وفصل البلازما عن طريق الطرد المركزي ونقل ثلاثة 250 ميكرولتر aliquots من جزء البلازما إلى فردي 1.5 ملليلتر أنابيب التفاعل.
ثم تجميد عينات البلازما في النيتروجين السائل للتخزين ناقص 20 درجة مئوية. لجمع البلازما CTAD، وملء CTAD التي تحتوي على monovettes مع 2.7 ملليلتر من الدم المسحوبة حديثا أو perfused عكس بعناية الأنابيب خمس مرات. ضع أحادية على الجليد لمدة 15-60 دقيقة قبل جمع البلازما عن طريق الطرد المركزي.
نقل 700 ميكرولترات من كل كسر البلازما المتوسطة في أنابيب التفاعل 1.5 ملليلتر الفردية والطرد المركزي أنابيب التفاعل شغل مرة أخرى. ثم نقل اثنين من 100 ميكرولتر aliquots من الكسر الأوسط في الفردية 1.5 ملليلتر ردود الفعل أنابيب وتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل لتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية. لقياس مستويات TAT في عينات البلازما سيترات، إضافة 50 ميكرولترات من العازلة عينة ELISA في كل بئر من 96 جيدا لوحة مسطحة أسفل و 50 ميكرولترات من معيار البلازما، ومراقبة البلازما، وعينات البلازما غير مخفف في التكرارات إلى الآبار المناسبة من لوحة.
بعد ختم لوحة، احتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من محلول الغسيل في كل بئر قبل إضافة 100 ميكرولترات من بيروكسيديز متقارنة الأجسام المضادة تات المضادة للإنسان إلى كل بئر. بعد حضانة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز، وغسل لوحة ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من محلول الغسيل الطازجة في البئر.
بعد الغسيل الأخير، أضف 100 ميكرولترات من محلول الكروموجين الطازج المعدة بشكل جيد لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، إضافة 100 ميكرولترات من حل التوقف إلى كل بئر وقراءة الكثافة البصرية على مقياس ضوئي في 490 إلى 500 نانومتر باستخدام بيانات منحنى القياسية كخط اتجاه لحساب تركيز تات لكل عينة. لتحضير الغرسات لفحص المجهر الإلكتروني، استخدم ملقط لإزالة الغرسات من الأنابيب وشطف كل غرسة ثلاث مرات في كلوريد الصوديوم الطازج 0.9٪لكل غسل.
بعد الغسيل الأخير، قم بتخزين الغرسات في حاويات فردية بنسبة 2٪ من الجلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، احتضان يزرع في حاويات فردية من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق قبل التجفيف يزرع في تركيزات تصاعدية من الإيثانول لمدة 10 دقيقة لكل تركيز كما هو مبين. مباشرة بعد جمع الدم و perfusion، يتم الكشف عن أي تغييرات في عدد من خلايا الدم البيضاء أو الحمراء أو في قيم الدماتوكريت.
ومع ذلك، يتم الكشف عن انخفاض في مستويات الهيموغلوبين بعد التسريب داخل نظام حلقة التدفق. ويلاحظ أيضا انخفاض في أعداد الصفائح الدموية، التي يتم زيادتها عندما الدعامة غير المصقولة موجودة داخل أنابيب. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الخسارة تنخفض عندما يتم احتضان الدم مع الدعامة المغلفة بالفيرين الهيبارين.
يتم زيادة تركيز معقّد تات أقلّيّة استجابة للضخ. ومع ذلك، عندما تضاف دعامة معدنية عارية، يتم الكشف عن زيادة كبيرة في TAT مما يدل على تنشيط عميق لنظام التخثر. استخدام الدعامة المغلفة بالفيبرين الهيبارين يمنع هذا التنشيط.
Perfusion يؤدي إلى زيادة تفعيل تتالي مجاملة التي لا تتأثر بوجود الدعامات غير المصقول أو الهبارين المغلفة. وبالمثل، يتم تنشيط حبيبات العدلات كما يتضح من القياس الكمي لمستويات العدلات المتعددة الأشكال. التصور عن طريق مسح المجهري الإلكترون يكشف عن وجود شبكة كثيفة من خلايا الدم والبروتينات على سطح الدعامة غير المصقول بعد الدعامة التي لم يلاحظها على الدعامات المغلفة بالفيربين الهيبارين.
من الأهمية بمكان التأكد من أن الدم يفي بمعايير الاشتمال للحصول على العينات واستخدام الدم المسحوب حديثاً في أسرع وقت ممكن. دم الإنسان قد تحتوي على الفيروسات المنقولة بالدم وغيرها من العوامل ويحمل خطر العدوى لذلك تأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة دائما عند التعامل مع العينات.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول نموذجًا لدراسة التوافق الحيوي للأجهزة التي تلامس الدم باستخدام غرسات عصبية وعائية مقطوعة بالليزر. إنه يقلد الظروف الفسيولوجية لتقييم التوافق الحيوي بفعالية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تقييم التوافق الحيوي
- بحث المواد الحيوية
- الدراسات ما قبل السريرية
الخلفية
- يتبع النموذج إرشادات منظمة المعيار الدولية.
- يقلل من الأحداث الجلطية وتركيز مضادات التخثر.
- يتم استخدام دم بشري طازج ومعالج بالهيبارين للاختبار.
- يتم تحليل المؤشرات الدموية بعد الجريان الوريدي.
غرض الدراسة
- لتقييم التوافق الحيوي للأجهزة التي تلامس الدم.
- لتوفير طريقة بسيطة لتقييم المواد الحيوية.
- لتسهيل الدراسات ما قبل السريرية على غرسات عصبية وعائية.
الطرق المستخدمة
- نموذج حلقة الجريان مع دم بشري طازج ومعالج بالهيبارين.
- تحضير قوارير محملة بالهيبارين لجمع الدم.
- تحليل مختلف المؤشرات الدموية.
- مقارنة النتائج مع القيم الأساسية من جمع الدم.
النتائج الرئيسية
- تقييم التوافق الحيوي بناءً على المؤشرات الدموية.
- تشير مقارنة النتائج إلى أداء الجهاز.
- مظاهرة فعالية النموذج لأبحاث المواد الحيوية.
- تأكيد إمكانية الاستخدام في الدراسات ما قبل السريرية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لتقييم التوافق الحيوي.
- يدعم تطوير أجهزة تلامس الدم الأكثر أمانًا.
- يمكن تكييف النموذج لدراسات مواد حيوية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Hemocompatibility testing is a critical gatekeeper in the development of blood-contacting implants, where thrombotic or inflammatory responses can derail clinical translation. This flow loop model provides a physiologically relevant, multiparametric assessment aligned with ISO 10993-4, enabling early de-risking of stent and catheter designs. By quantifying platelet, leukocyte, coagulation, and complement activation using fresh human whole blood, it delivers predictive confidence for go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of material-blood interactions to clarify thrombogenic and inflammatory pathways.
- Operational Value: Supports functional validation of biomaterials by linking surface properties to hematologic outcomes.
- Predictive Value: Generates quantitative biomarkers (e.g., TAT, β-TG, PMN-elastase, SC5b-9) for mechanistic de-risking of implant candidates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized, reproducible blood perfusion conditions for consistent compound or coating evaluation.
- Quantitative Output: Delivers multiparametric readouts that enable dose-response screening of anticoagulant or anti-inflammatory modifications.
- Scalability: Uses a modular flow loop design adaptable to high-throughput screening of stent variants or biomaterial libraries.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human hemodynamics at 37°C and 150 mL/min to reflect neurovascular implant conditions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical studies by preserving blood physiology through gentle handling and heparinization.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies coating efficacy (e.g., fibrin-heparin) in reducing coagulation activation, informing preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early biomaterial screening, assay validation, and mechanistic profiling before animal studies.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about surface-mediated blood activation using clinically relevant flow conditions.
- Screening: Enables standardized assessment of hemocompatibility across material iterations with quantitative hematologic endpoints.
- Analytics: Measures platelet consumption, leukocyte activation, coagulation (TAT), and complement (SC5b-9) to compare device performance.
- Translational Research: Uses fresh human blood to enhance physiological relevance and reduce species-specific extrapolation risk.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse blood-contacting devices across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in blood-device interactions through multiparametric, pathway-specific biomarkers.
- Operational Value: Ensures standardization via ISO 10993-4 alignment, reproducible flow rates, and controlled temperature.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by predicting thrombotic and inflammatory risk prior to costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of implant designs based on hemocompatibility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hematologic assay handling and blood sample preparation to avoid preactivation.
- Depends on perfusion infrastructure including peristaltic pumps, temperature-controlled baths, and heparinized tubing.
- Necessitates cross-team standardization for blood collection, processing, and biomarker assay execution (e.g., ELISA for TAT, SC5b-9).
- Involves adaptation considerations when testing non-neurovascular implants due to flow rate and shear stress specificity.
- Limited by the need for fresh human blood and short ex vivo viability, constraining batch size and timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:50
Heparin-Loaded Monovette Preparation and Blood Sampling
1:44
Flow Loop Preparation
2:24
Hemocompatibility Testing
2:51
Whole Blood Count Analysis
3:25
Citrate Plasma Collection
4:05
EDTA and Citrate, Theophylline, Adenosine, and Dipyridamole (CTAD) Plasma Collection
5:19
Thrombin-Anti-Thrombin III (TAT) Quantification
6:48
Scanning Electron Microscopy (SEM) Sample Preparation
7:30
Results: Representative Hemocompatibility Testing
9:02
Conclusion
