نظام ثقافة الرئة المتعددة الأبعاد لنموذج سرطان الرئة الحرشفية
مارس 17, 2020
تم تطوير نظام نموذج في المختبر لالتقاط التغيرات المعمارية الأنسجة أثناء سرطان الرئة الحرشفية (LUSC) التقدم في ثقافة 3-الأبعاد (3D) المشتركة مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs). يوفر هذا النظام العضوي منصة فريدة من نوعها للتحقيق في أدوار التغيرات المتنوعة الجوهرية للخلايا السرطانية والخارجية التي تعدل النمط الظاهري للورم.
نظام ثقافتنا يلتقط اللدونة الظاهرية من خلايا سرطان الخلايا الحرشفية الرئة استجابة لتفاعلات الورم stroma وكيف تنظم هذه التفاعلات مورفولوجيا الورم خلال تطور سرطان الخلايا الحرشفية في الرئة. الميزة الرئيسية لنظامنا هو قدرته على نموذج بيولوجيا الخلايا الحرشفية الرئة في سياق 3D مع الحفاظ على اللدونة من الخلايا الخبيثة. توفر هذه الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد نظامًا فريدًا للتحقيق في تفاعلات الخلايا الورمية القوية ويمكن تكييفها لمراقبة استجابات خلايا سرطان الخلايا الحرشفية في الرئة والأورام الليفية المرتبطة بالسرطان لعلاج الدواء.
للبدء، ذوبان قنينات مصفوفة غشاء الطابق السفلي في ثلاجة أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. تهدئة الماصات البلاستيكية ملليلتر ونصائح في ناقص 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، تدفئة الكواشف المستخدمة لتفكك الخلايا TUM622 ، العازلة HEPES ، التربسين / EDTA ، و عازلة تحييد التربسين في حمام مائي 37 درجة مئوية.
خذ مصفوفة غشاء الطابق السفلي المذابة من الثلاجة ووضع القارورة على الجليد. يبرد لوحات ثقافة الأنسجة على برودة منصة معدنية وضعت على الجليد. ضع أنابيب الطرد المركزي على رف تبريد معدني على الجليد.
حساب كمية الخلايا اللازمة على أساس عدد الآبار وتركيز الخلايا في كل بئر لتكون مستعدة. نقل TUM622 تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي المبرد وتدور في 300 مرة ز في جهاز طرد مركزي دلو معلقة في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. مع ماصة التعرق تعلق على طرف غير المصفاة، pirate عظمى بعناية، وترك ما يقرب من 200 ميكرولترات من المتوسطة في الأنبوب.
اضغط بلطف على جانب الأنبوب لإزاحة البيليه وفكها ثم إعادتها إلى رف التبريد. باستخدام ماصات مُبَرَّكة من مليلترتين، اخلط بلطف المصفوفة على الجليد عن طريق الأنابيب صعوداً وهبوطاً عدة مرات. الماصات في سرعة حتى ومعتدل بحيث يتم إدخال أي فقاعات في المصفوفة أثناء هذا الإجراء.
نقل 1.1 ملليلتر من المصفوفة إلى كل أنبوب طرد مركزي. باستخدام النصائح precooled، ماصة المصفوفة في كل أنبوب صعودا وهبوطا حوالي 10 مرات لجعل تعليق خلية موحدة. نقل 310 ميكرولترات من تعليق مصفوفة الخلية في كل بئر من لوحة 24-جيدا.
ضع الماصات بزاوية 90 درجة على سطح اللوحة وأضف التعليق إلى مركز البئر. التعليق ينتشر ويغطي البئر بأكمله. لتسهيل تحليل الفلورة المناعية المصب، نقل 60 ميكرولترات من تعليق مصفوفة الخلية إلى مركز البئر من شريحة غرفة بئرين.
وهذا يسمح للمصفوفة لتشكيل هيكل يشبه القبة مع حجم أصغر بكثير. العودة لوحة وغرفة الشريحة مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة الأنسجة واحتضان لمدة 30 دقيقة للسماح للمصفوفة لترسيخ. بعد ذلك، فحص لوحة والانزلاق تحت مجهر الضوء لضمان أن يتم توزيع الخلايا الفردية بالتساوي داخل المصفوفة.
أضف ملليلتر واحد من ثقافة ثلاثية الأبعاد ساخنة مسبقًا بشكل كامل في كل بئر من الآبار و1.5 ملليلتر من 3D ثقافة متوسطة في كل بئر من شريحة الغرفة ، ثم إعادتها إلى الحاضنة. بعد إعداد تعليق الخلية من TUM622 وCAFs كما هو موضح سابقا، عد كثافة الخلية CAF عن طريق خلط 10 ميكرولترات من تعليق الخلية مع 10 ميكرولترات من الأزرق trypan. إضافة 10 ميكرولترات من الخليط إلى كل من الغرفتين على قياس الهيموزيت لحساب وحساب كثافة الخلية.
لتضمين الخلايا TUM622 و CAFs في مصفوفة غشاء الطابق السفلي، أولاً حساب العدد المطلوب من الخلايا المستخدمة في الطلاء استناداً إلى معلومات كثافة الخلايا. يتم تصنيف CAFs بنسبة 2:1 من خلايا TUM622. نقل حجم محسوبة من TUM622s وكذلك تعليق الخلية CAF في نفس أنبوب الطرد المركزي.
تدور أسفل وpirate كل المتوسطة. Resuspend في مصفوفة غشاء الطابق السفلي ولوحة 310 ميكرولترات من الخليط في كل بئر من لوحة 24-جيدا. بالنسبة للفلوروس المناعي، نقل 60 ميكرولترات من خليط TUM622 و CAF إلى شرائح الغرفة كما هو موضح سابقا.
لزراعة االتكتميم TUM622 مع CAFs مضاف في مصفوفة غشاء الطابق السفلي، أول إعداد TUM622 أحادية الثقافة كما هو موضح سابقا، ونقل ضعف عدد تعليق CAF في أنبوب الطرد المركزي، وتدور في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استلهمت من فوق و resuspend CAFs في الوسط الثقافة، نقل ضعف عدد الخلايا CAF التي تم إعادة تعليقها في وسط الثقافة في كل من الآبار التي تحتوي على الخلايا TUM622 جزءا لا يتجزأ. يتم تقريب خلايا TUM622 النموذجية في الثقافة 2D مع نواة كبيرة في حين أن CAFs مسطحة وممدود.
بذر في ثقافة 3D، كانت خلايا TUM622 واحدة قادرة على تشكيل organoids مع المورفولوجيا acinarlike عندما جزءا لا يتجزأ. بين الأيام الخامسة والسابعة، أصبح التجويف واضحاً في الهياكل الشبيهة بالتجويف وظلت جوفاء بعد ذلك. كل acinus، تتألف من أحادية من الخلايا المحيطة تجويف تجويف، وعرض القطب الأساسي apical المناسبة مماثلة لتلك التي من ظهارة الرئة في الجسم الحي.
وكانت هذه الهياكل acinarlike hyperplastic واستمر في النمو حتى 24 يوما قبل مصفوفة خارج الخلية تفككت تماما. في الثقافات المشتركة TUM622-CAF، إما تراكب أو شارك في تضمين، وجود CAFs عزز إلى حد كبير عدد وحجم الزفير التي تشكلت. ومن المثير للاهتمام, عندما جاء TUM622 acini إلى قرب وثيق مع CAFs, أنها تسببت acini لتصبح الغازية والهجرة نحو CAFs, تشكيل الهياكل المسيل للدموع مثل.
لضمان تشكيل قوي من هياكل acinarlike، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على مصفوفة غشاء الطابق السفلي في شكله السائل خلال عملية كاملة من تضمين الخلايا. يمكن استخدام العضيات TUM622 لمجموعة متنوعة من التحليلات المصب، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، المناعة، والكيمياء المناعية، وقياس التدفق، والRNA واستخراج البروتين، ويمكن أيضا أن تعدل لفحص المخدرات. باستخدام هذا النظام كمنصة، يمكن للمرء أن التحقيق في كيفية الخلايا الورم الجوهرية وكذلك التغيرات الخارجية الخلية في البيئة الدقيقة الورم يمكن أن تؤثر على بنية الورم الظهارية وتشكيل سرطان.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة نظام نموذج مخبري (in vitro) لاستكشاف التغيرات في البنية النسيجية أثناء تطور سرطان الرئة الحرشفى (LUSC). ويسمح الاستنبات المشترك ثلاثي الأبعاد مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) بالتحقيق في التغيرات الذاتية والخارجية للخلايا الورمية والتي تؤثر على النمط الظاهري للورم.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأورام
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- تظهر سرطانة الخلايا الحرشفية في الرئة (LUSC) مرونة في النمط الظاهري.
- تلعب التفاعلات بين الورم والسدى دوراً حاسماً في تنظيم مورفولوجيا الورم.
- تعد أنظمة الزرع ثلاثية الأبعاد (3D) أساسية لنمذجة البيولوجيا المعقدة للأورام.
- يمكن أن يساعد فهم هذه التفاعلات في تطوير علاجات موجهة.
الغرض من الدراسة
- نمذجة بيولوجيا الخلايا الحرشفية الرئوية في سياق ثلاثي الأبعاد.
- استقصاء التفاعلات بين الخلايا الورمية والأرومات الليفية المرتبطة بالسرطان.
- تقييم مدى قابلية النظام للتكيف مع استجابات العلاج الدوائي.
الطرق المستخدمة
- تطوير نظام استزراع مشترك ثلاثي الأبعاد.
- إذابة وتحضير مصفوفة الغشاء القاعدي.
- تفكيك خلايا TUM622 باستخدام محاليل منظمة محددة.
- مراقبة التفاعلات بين الورم والسدى في المختبر.
النتائج الرئيسية
- يلتقط النظام بفعالية مرونة خلايا LUSC.
- تؤثر التفاعلات مع CAFs بشكل كبير على مورفولوجيا الورم.
- يُعد التكييف لمراقبة العلاج الدوائي أمراً ممكناً.
- يوفر النموذج رؤى حول بيولوجيا الورم والاستجابات العلاجية.
الاستنتاجات
- يُعد نظام الزراعة المشتركة ثلاثي الأبعاد أداة قيمة لدراسة سرطان الخلايا الحرشفية الرئوي (LUSC).
- يمكن أن يساهم فهم التفاعلات بين الورم والسدى في توجيه الاستراتيجيات العلاجية.
- قد يساهم هذا النموذج في تعزيز تطوير علاجات موجهة للسرطان.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تعالج نمذجة التفاعلات بين الورم والسدى في سياق ثلاثي الأبعاد (3D) ذي صلة فسيولوجياً فجوة حرجة في اكتشاف أدوية سرطان الرئة حرشفي الخلايا، حيث تفشل الأنظمة التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) في رصد اختلال البنية الظهارية والأنماط الظاهرية الغازية. وتتيح منصة العضوانيات (organoid) هذه تقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف من خلال الحفاظ على المرونة النمطية للخلايا السرطانية ومحاكاة التأثيرات الديناميكية للبيئة الدقيقة، مما يدعم الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف وحملات الفرز النمطي الظاهري. كما أن قدرة النظام على التكيف مع التحليلات اللاحقة تجعله إمكانية قابلة لإعادة الاستخدام عبر سير العمل بدءاً من الاكتشاف المبكر وصولاً إلى الدراسات قبل السريرية، مما يقلل من معدلات الفشل البيولوجي في محافظ أبحاث الأورام.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال نمذجة كيفية تنظيم التفاعلات بين الورم والسدى للبنية الظهارية أثناء تطور السرطانة.
- القيمة التشغيلية: تمكين التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال ملاحظة المورفولوجيا الغازية الناجمة عن الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) وتكوين هياكل تشبه العنيبات في نظام ذي صلة بالمرض.
- القيمة التنبؤية: دعم فرز محفظة الأدوية من خلال رصد اللدونة المظهرية لخلايا سرطانة الرئة الحرشفية استجابةً لإشارات البيئة الدقيقة.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يعمل على تجهيز أنظمة بيولوجية مصادق عليها لفحص المركبات عن طريق الحفاظ على مورفولوجيا شبيهة بالعنيبات مع قطبية قمة-قاعدة مناسبة على مدى فترات استزراع ممتدة.
- القيمة التشغيلية: يوحد نتائج المقايسة من خلال مخرجات هيكلية قابلة للقياس الكمي، مثل حجم الكرويات وعددها والتكوينات الغازية الشبيهة بقطرة الدم استجابةً للإشارات السدوية.
- قيمة القابلية للتوسع: يسهل إعادة استخدام المنصة لمراقبة العلاج الدوائي، حيث يمكن تكييف الاستزراع المشترك لتقييم استجابات كل من الخلايا الورمية والأرومات الليفية المرتبطة بالسرطان للتدخلات العلاجية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة الترجمية: ينمذج ديناميكيات النظام ذات الصلة بالمرض من خلال إعادة إنتاج السمات الرئيسية لبنية أنسجة سرطان الرئة الحرشفية والتفاعلات السدوية الملاحظة في عملية التسرطن.
- الاستمرارية قبل السريرية: يربط بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال تمكين تحليل الآليات الجوهرية والخارجية للخلايا الورمية التي تعزز التفكك الظهاري، مما يساهم في اتخاذ قرارات تقدم مدروسة بناءً على تقييم المخاطر.
- توافق المؤشرات الحيوية: يدعم اكتشاف المؤشرات الحيوية الترجمية من خلال التوافق مع سير عمل استخلاص البروتينات وRNA، والصبغ الكيميائي النسيجي المناعي، والصبغ المناعي الفلوري في المراحل اللاحقة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضيات الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الواعدة والتحقق من الصلاحية في المرحلة قبل السريرية، وذلك بفضل قدرتها على نمذجة التفاعلات الديناميكية بين الورم والسدى وتمكين الحصول على قراءات مظهرية كمية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال الكشف عن كيفية تعزيز التضمين المشترك أو التراكب للخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) لتكوين الكريات وتحفيز المورفولوجيا الغازية التي تشبه قطرة الدم في العنيبات من نوع TUM622.
- الفحص: يوفر الجاهزية للاختبار من خلال تكوين استزراع مشترك ثلاثي الأبعاد (3D coculture) قابل للتكرار، مما يسمح بتقييم معياري لتأثيرات المركبات على أنظمة الاستزراع المشترك بين الورم والسدى.
- التحليلات: يتيح قياسات كمية لتكوين البنى الشبيهة بالعنيبات، وتطور اللمعة، وحجم الكريات، وأنماط الهجرة الغازية لمقارنة الظروف التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بالعمل ما قبل السريري من خلال نمذجة اختلال البنية الظهارية والغزو المدفوع بالسدى، وهي عمليات أساسية في تطور السرطوم ذات صلة بالتدخل العلاجي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يعمل كمنصة قابلة للتكيف بدلاً من كونها تقنية ذات استخدام واحد، حيث يتوافق مع تطبيقات التألق المناعي، وقياس التدفق الخلوي، وفحص الأدوية عبر مشاريع مختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية من خلال نمذجة اللدونة المظهرية للخلايا الورمية والتغيرات المورفولوجية المعتمدة على السدى في نظام ثلاثي الأبعاد لسرطان الرئة حرشفي الخلايا.
- القيمة التشغيلية: تضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال نسب خلوية محددة (2:1 CAF:TUM622)، وبروتوكولات التعامل مع المصفوفة، والأنماط المظهرية الهيكلية القابلة للقياس الكمي.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف عن المشروع عن طريق تقليل المخاطر المرتبطة بالأهداف من خلال ملاحظة الغزو المدفوع بالبيئة الدقيقة والتعطيل الظهاري، مما يقلل من مخاطر الفشل البيولوجي في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة الاستثمارية: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال تحديد الأهداف التي يؤثر تعديلها على التفاعلات بين الورم والسدى والتحولات من الشكل العنيبي إلى الغازي في نموذج ذي صلة فسيولوجياً.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الأولية، والتعامل مع المصفوفة خارج الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D extracellular matrix)، والتقنيات المعقمة لإعداد الزراعة المشتركة.
- يعتمد على توفر مصفوفة الغشاء القاعدي، ومعدات التحكم في درجة الحرارة (4°C، 37°C)، والمجهر الضوئي المقلوب لتقييم المورفولوجيا.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق في تحضير الخلايا، وخلط المصفوفة، وبروتوكولات الزراعة لضمان تكوين بنية شبيهة بالعنيبات (acinar-like structure) بشكل متسق بين المستخدمين.
- يتطلب مراعاة اعتبارات التكيف عند التوسع في أنواع أخرى من الأرومات الليفية أو نماذج الأورام بخلاف TUM622 والأرومات الليفية المرتبطة بسرطان الرئة حرشفي الخلايا (CAFs).
- تشمل القيود العملية الحاجة إلى الحفاظ على المصفوفة في الحالة السائلة أثناء التضمين، والفترة الزمنية المحدودة للزراعة قبل تفكك المصفوفة (~24 days)، وفقاً للمواد المصدرية.
