Name: النمذجة المناعية التنبؤية للأورام الصلبة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: اكتشف طريقة قياس الملفات المناعية في الأورام الصلبة باستخدام نماذج التعبير الجيني القائمة على الحمض النووي الريبوزي. تساعد هذه التقنية الباحثين على فهم استجابات المناعة والتقدم المرضي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يرغب المؤلفون في التنويه بمجموعة TriStar Technology Group لتوفير العينات البيولوجية للنتائج التمثيلية ، بالإضافة إلى جميع الفرق الجزيئية والتحليلية والمنتجة والتجارية في Cofactor Genomics لخبرتهم التقنية و دعم.

<ol><li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li>
<li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-infiltrating+lymphocytes%2C+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients%3A+clinicopathological+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li>
<li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li>
<li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Sequencing+in+Cancer%3A+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Inform%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li>
<li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes%3A+From+visual+estimation+to+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li>
<li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18(2017).</li>
<li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((xCell%3A+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220(2017).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li>
<li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218(2016).</li>
<li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128(2017).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154(2018).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612(2013).</li>
<li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li>
<li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis%3A+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482(2019).</li>
<li>PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO. , OncologyPRO. https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer (2019).</li>
<li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535(2019).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Schillebeeckx, I., et al. Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting. Journal of Molecular Diagnostics. 21, Baltimore, MD. (2019).</li>
<li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+%28TILs%29+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25(2018).</li>
<li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD4%2FCD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li>
<li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).</li>
</ol>

يتم توظيف جميع المؤلفين من قبل Cofactor Genomics, Inc. ، الشركة التي طورت وتنتج مجموعة كاشفات ImmunoPrism وأدوات المعلوماتية المستخدمة في هذه المقالة. إن اختبار ImmunoPrism هو للاستخدام البحثي فقط، وليس للاستخدام في الإجراءات التشخيصية.

يتطلب البروتوكول 20 نانوغرام سليمة أو 40 نانوغرام تدهورت للغاية (FFPE) RNA. يجب أن تكون عينة الحمض النووي الريبي خالية من الحمض النووي أو الأملاح (على سبيل المثال، Mg2+أو أملاح الجوانيدينيوم) أو عوامل التكالال العرافة (على سبيل المثال، EDTA، EGTA، السيترات)، أو المواد العضوية (على سبيل المثال، الفينول والإيثانول). فمن غير المستحسن المضي قدما مع عينات الجيش الملكي النيبالي التي لديها DV200 < 20٪. يوصى بشدة باستخدام الحمض النووي الريبي في مجموعة التحكم لأن هذه الضوابط توفر وسيلة لتقييم الأداء في جميع أنحاء البروتوكول بأكمله ، من إعداد المكتبة إلى التحليل.
تم تصميم البروتوكول ليتم تنفيذه باستخدام أنابيب قطاع PCR 0.2 مل. إذا كان يفضل، يمكن أيضا تنفيذ البروتوكول باستخدام الآبار في لوحة PCR 96-جيدا. ما عليك سوى استخدام آبار لوحة PCR 96-well بدلاً من جميع الإشارات إلى أنابيب PCR أو أنابيب الشريط. استخدام لوحات PCR مع آبار واضحة فقط، كما أنه من الأهمية بمكان لتأكيد بصريا إعادة التعليق الكامل للحبات أثناء تنقية الخرز وخطوات الغسيل.
طوال البروتوكول، احتفظ بالكواشف مجمدة أو على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك. لا تستخدم الكواشف حتى يتم إذابتها بالكامل. تأكد من خلط جميع الكواشف جيدا قبل الاستخدام.
الحفاظ على الإنزيمات عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام والعودة إلى -20 درجة مئوية على الفور بعد الاستخدام. استخدام المياه الخالية من nuclease الجزيئية فقط؛ لا ينصح باستخدام المياه المعالجة بـ DEPC. عندما pipetting لخلط، يستنشق بلطف والاستغناء عن ما لا يقل عن 50٪ من الحجم الإجمالي حتى يتم خلط الحلول بشكل جيد. ماصة مزيج جميع يمزج الرئيسي التي تحتوي على الإنزيمات. استخدام دوامة لخلط الإنزيمات يمكن أن يؤدي إلى التسخ وللخطر أدائها. أثناء تنقية الخرز، استخدم حلول الإيثانول الطازجة بنسبة 80٪ من الإيثانول الجزيئي. استخدام حلول الإيثانول التي ليست طازجة قد يؤدي إلى انخفاض الغلة. تجنب أكثر من تجفيف الخرز، وهذا يمكن أن تقلل من كفاءة elution (حبات تبدو متصدع إذا أكثر من المجففة).
كما هو موضح في الخطوة 10، يتم إضافة التمهيديات فهرس فريدة من نوعها إلى كل رد فعل. استناداً إلى تسلسل هذه المؤشرات، لتعدد المستوى المنخفض، تركيبات مؤشر معينة هي الأمثل. وتسلسل هذه المؤشرات مطلوب من أجل إزالة الطابع المتعدد للبيانات بعد التسلسل. يتم توفير التسلسلات ومجموعات تعدد الإرسال الموصى بها في الجدول التكميلي 3. في هذه الخطوة نفسها، من المهم ملاحظة أن عدد دورات PCR الموصى بها يختلف اعتماداً على نوعية الحمض النووي الريبي المستخدمة، وقد تكون هناك حاجة إلى بعض التحسين لمنع PCR الإفراط في التضخيم. للحصول على جهاز ImmunoPrism Intact Control RNA وغيره من الحمض النووي الريبي عالي الجودة، ابدأ التحسين مع 10 دورات PCR. لImmunoPrism FFPE التحكم RNA وغيرها من الحمض النووي الريبي المتدهورة للغاية / FFPE ، بدء التحسين مع دورات 15 PCR. يوصى بإنتاج مكتبة اختبار باستخدام ممثل الحمض النووي الريبي للمواد التي سيتم تحليلها من أجل تحسين دورات PCR. وينبغي استخدام الحد الأدنى لعدد دورات PCR التي تسفر باستمرار عن غلة كافية من المكتبة قبل الالتقاط (أكثر من 200 نانوغرام). ذروة ثانوية حول 1000 bp على تتبع Bioanalyzer يدل على الإفراط في التضخيم(الشكل 4). يجب تقليل التضخيم المفرط ، ولكن وجود ذروة ثانوية صغيرة لن يتداخل مع نتائج الخفض.
لتقليل فقدان العينة وتجنب تبديل الأنابيب، يمكن تنفيذ الخطوة 13 في أنابيب PCR أو أنابيب الشريط أو لوحة PCR 96-well بدلاً من 1.5 مل ميكروأنابيب، إذا كان تركيز الفراغ الخاص بك يسمح. يمكن إزالة الدوار على العديد من المكثفات. وهذا يمكن أنابيب الشريط أو لوحات لتناسب في الفراغ. ويمكن بعد ذلك تشغيل تركيز الفراغ باستخدام إعداد الجفاف مائي مع عدم وجود centrifugation. راجع دليل للتركيز فراغ الخاص للحصول على تعليمات. إذا تم تجفيف العينات في أنابيب الشريط أو لوحة 96-well ، يمكن تنفيذ خطوة التهجين في نفس الوعاء.
خلال الخطوة 17، تأكد من دوامة كل 10-12 دقيقة لزيادة كفاءة التقاط البزة. عقد بعناية قبعات أنابيب الشريط الدافئ عند خلط لمنع الأنابيب من فتح.
والسُلمات الموصوفة في الخطوة 18 حاسمة لتجنب التلوث غير المحدد ويجب متابعتها عن كثب. تأكد من إعادة تعليق الخرز بالكامل في كل غسل ، وإزالة مخازن الغسيل تمامًا ، وخلال غسل العازلة 2 ، قم بنقل العينات إلى أنبوب شريط جديد (الخطوة 18.6.5). تأكد من أن حبات ستريبتفيفيفيسين يتم إعادة تعليقها بالكامل وتبقى معلقة أثناء الحضانة بأكملها. الرش على قبعات أنبوب لن يؤثر سلبا على التقاط. خلال النظافة في درجة حرارة الغرفة، يمكن استخدام خلاط دوامة ميكروبليت لدوامة العينات لكامل فترة الحضانة لمدة دقيقتين لتسهيل إعادة التعليق. لا تدع حبات ستريبتفيفيفيفيدين تجف. إذا لزم الأمر، قم بتمديد الحاضنات في المخازن المؤقتة لتجنب تجفيف الخرز. إذا كنت تستخدم أكثر من أنبوب قطاع واحد، والعمل مع أنبوب قطاع واحد في وقت واحد لكل غسل في حين أن أنابيب الشريط الأخرى الجلوس في cycler الحرارية. وهذا يمكن أن يساعد على تجنب أكثر من تجفيف الخرز أو التسرع، مما أدى إلى إعادة تعليق الفقراء أو غيرها من التقنيات دون المستوى الأمثل. للمستخدمين لأول مرة، لا ينصح بمعالجة أكثر من 8 ردود فعل المكتبة في وقت.
توفر تقنيات التنميط المناعي الحالية سلسلة متصلة من المعلومات - من آلاف نقاط البيانات التي تتطلب تفسيرًا كبيرًا (تسلسل الحمض النووي الريبي) إلى نقطة بيانات فردية ومنفصلة (IHC واحد plex). البروتوكول الموصوف هنا يمثل نهجا في مكان ما في الوسط، مع نطاق مركز ة تمكن حساسية عالية، ولكن التقاط سوى مجموعة فرعية من البيانات المحضرة ذات الصلة سريريا. نظرًا لطبيعة استخراج الحمض النووي الريبي السائب ، لا يوفر هذا البروتوكول معلومات حول العلاقات المكانية بين الخلايا المناعية والبيئة الدقيقة للورم ، ومع ذلك ، يمكن استكمال النتائج بتقنيات التصوير لإضافة هذه المعلومات. هناك عدد لا يحصى من التطبيقات للبيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول ، حيث أن هناك الكثير مما يمكن تعلمه عن بيولوجيا السرطان كمرض ، والعلاجات التي يتم تطويرها لعلاجه. كما هو مبين في النتائج التمثيلية ، فإن تقرير المناعة الفردي مفيد لفهم كيف قد يتغير الملف المناعي للمريض استجابة لأحداث مثل تطور المرض أو العلاج. في حين أن النتائج المعروضة هنا تقدم بعض حالات الاستخدام المثال ، والتطبيقات الأخرى بما في ذلك التحقيق في آلية عمل العلاج وتحديد المؤشرات البيولوجية المفترضة للنتائج السريرية مثل التقدم مجانا والبقاء على قيد الحياة عموما هي أيضا العمليه. عند استخدام هذا البروتوكول لتطبيقات اكتشاف العلامات الحيوية ، من المهم ممارسة تصميم دراسة جيد لضمان تحليل التجمعات المتجانسة ، ويتم تضمين عينات كافية للقوة الإحصائية ، ويتم النظر في مصادر التحيز. نظرًا للطبيعة المركزة والمبسطة للدراسة ، من الممكن تخيل مسار نحو التحقق السريري والتطبيق المصب لهذه المؤشرات الحيوية بمجرد اكتشافها.

القياس الكمي للخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) والجزيئات الأخرى ذات الصلة بالمناعة في الفورمالين الثابتة والبارافين المضمنة (FFPE) أظهرت عينات الأنسجة البشرية للورم الصلب قيمة في البحوث السريرية1،2،3. التقنيات الشائعة مثل قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض الريبي النووي أحادي الخلية (RNA) مفيدة للأنسجة الطازجة والدم4، ولكنها غير مناسبة لتحليل مواد FFPE بسبب عدم القدرة على إنشاء تعليق خلية قابلة للحياة. الأساليب الحالية التي تم استخدامها لتحديد هذه الخلايا في أنسجة FFPE تعاني من تحديات كبيرة. تتطلب الكيمياء المناعية (IHC) وغيرها من مهام سير العمل التصويرية المماثلة أجسامًا مضادة محددة للكشف عن بروتينات سطح الخلية ، والتي قد يكون من الصعب توحيدها عبر المختبرات لتمكين القياس الكمي القابل للتكرار5. منصات مثل نظام nCounter تعتمد على التعبير عن جينات واحدة لتحديد الخلايا المناعية الرئيسية6، والحد من حساسية وخصوصية الكشف. أكثر عام أساليب تسلسل الجيش الملكي النيبالي، إلى جانب أدوات البرمجيات المستقلة، متوفرة ولكن تتطلب التحسين والتحقق من الصحة كبيرة قبل استخدام7،8،9،10،11،12. وقد أظهرت التطورات الأخيرة في الجمع بين الميكروديس التقاط الليزر (LCM) مع تسلسل الحمض النووي الريبي لأنسجة FFPE واعدة; ومع ذلك ، مطلوب حل تسليم المفتاح أكثر إنتاجية للدراسات الانتقالية التي تهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية القوية13،14. أساليب توليد المؤشرات الحيوية متعددة الأبعاد، مثل النمذجة المناعية التنبؤية، التي تحدد أفواج المرضى بما في ذلك المستجيبين العلاج، والأنواع الفرعية للسرطان، أو نتائج البقاء على قيد الحياة مع دقة تنبؤية عالية وأهمية إحصائية أصبحت ذات أهمية متزايدة في عصر الطب الدقيق والعلاج المناعي15،16.
ولتلبية هذه الحاجة، تم تطوير فحص التنميط المناعي لتمكين التحديد الكمي الحساس والمحدد للخلايا المناعية في أنسجة FFPE الورم الصلبة باستخدام الكواشف الموحدة لتسلسل الحمض النووي الريبي والمعلوماتية المستندة إلى السحابة. بالإضافة إلى استيعاب الحمض النووي الريبي المتدهور من أنسجة FFPE ، فإن البروتوكول قادر على استيعاب الحمض النووي الريبي المشتق من عينات الأنسجة الحدية مثل خزعات الإبر الأساسية ، واستنشاق الإبر ، والأنسجة المجهرية أو الكلية. تتم مقارنة بيانات الحمض النووي الريبي من كل عينة بقاعدة بيانات لنماذج التعبير الجيني للخلايا المناعية، تسمى نماذج التعبير الصحي المناعي، لتحديد الخلايا المناعية كنسبة مئوية من إجمالي الخلايا الموجودة في العينة. باختصار ، تم بناء هذه النماذج باستخدام أساليب التعلم الآلي لتحديد أنماط التعبير الفريدة متعددة الأعراق من بيانات النسخ الكامل الناتجة عن مجموعات الخلايا المناعية النقية (معزولة باستخدام علامات سطح الخلية الكنسية)17،18. نماذج التعبير الصحي متعددة الأبعاد الكامنة وراء التكنولوجيا تمكن من فحص لتحديد كل خلية مناعية في المئة من مجموع الخلايا الموجودة في خليط غير متجانس. وهذا يمكّن الباحث من إنشاء مقارنات بين الخلايا المناعية وداخل العينة ، والتي ثبت أن لها قيمة سريرية19،20. وتشمل التطبيقات الأخرى القياس الكمي للاستجابة المناعية قبل وبعد العلاج، كما هو موضح في النتائج التمثيلية. تقارير عن دراسة سمات متعددة من السياقات المناعية للورم والبيئة الدقيقة للورم بما في ذلك النسب المئوية المطلقة من ثمانية أنواع الخلايا المناعية (المستمدة من نماذج التعبير الجيني): CD4+ الخلايا T، CD8+ الخلايا التائية، CD56+ الخلايا القاتلة الطبيعية، CD19+ B الخلايا، CD14+ monocytes، Tregs، M1 الضامة، وM2 الضامة. بالإضافة إلى ذلك، تقارير النسخة المحددة التعبير (في النصوص لكل مليون، أو TPM) من عشر جينات الهروب المناعي: PD-1، PD-L1، CTLA4، OX40، TIM-3، BTLA، ICOS، CD47، IDO1، و ARG1.
يتم استخدام مجموعة الكاشف لجعل المكتبات عالية الجودة جاهزة للتسلسل على منصة Illumina باتباع طريقة إعداد مكتبة هجينة تعتمد على الالتقاط ، كما هو موضح في الشكل 1. إذا لم يكن لدى الباحث منصة تسلسل Illumina في مختبره ، فقد يقدم عيناته إلى مختبر أساسي للتسلسل. وبمجرد توليدها، يتم تحميل بيانات التسلسل إلى بوابة Prism لتحليلها آليًا، ويتم إرجاع ملف تعريف كمي شامل لكل عينة فردية، في شكل تقرير المناعة(الشكل 2A)،إلى المستخدم. يمكن للمستخدمين أيضًا تعريف مجموعات العينات في بوابة Prism لإنشاء تقرير العلامات الحيوية(الشكل 2B)، مع تسليط الضوء على المؤشرات الحيوية ذات الأهمية الإحصائية التي تميز مجموعتين من المرضى. والأهم من ذلك أن البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة مجموعة الكاشف هي للاستخدام البحثي فقط ولا يجوز استخدامها لأغراض التشخيص.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل. في هذا البروتوكول، يتم تحويل الحمض النووي الريبي أولاً إلى cDNA. يتم ربط محولات التسلسل ، ويتم تضخيم cDNA المحول - ليغاتيد وباركوديد من قبل PCR لإنشاء مكتبة ما قبل الالتقاط. ثم يتم تهجين المجسات Biotinylated إلى أهداف cDNA محددة والتي يتم التقاطها بعد ذلك باستخدام حبات ستريبتافيفيسين. تتم إزالة cDNA غير المنضمة وغير المستهدفة عن طريق الغسيل. ينتج عن تخصيب PCR النهائي مكتبة ما بعد الالتقاط جاهزة للتسلسل. * يجب أن يكون مجموع الحمض النووي الريبي من عينات بشرية؛ قد تكون سليمة أو المتدهورة (FFPE) RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> الشكل 2: تقارير المناعة التمثيلية. يقوم سير العمل بإنشاء تقريرين، وتقرير مناعة فردي(A)لكل عينة تتم معالجتها، وتقرير علامة بيولوجية(B)لأفواج المرضى المحددة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يتطلب البروتوكول حوالي 16 ساعة من وقت التحضير (من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى المكتبات الجاهزة للتسلسل)؛ ومع ذلك، هناك عدد من نقاط التوقف الاختيارية، كما هو موضح في البروتوكول. والمواد النظرية تستخدم الطبيعة الغنية والديناميكية للنسخ للإنتقال من المؤشرات الحيوية أحادية التدليل إلى نماذج التعبير الجيني المتعدد الأبعاد، مما يتيح التوصيف البيولوجي الشامل لعينات الأنسجة مع توحيد الكواشف وأدوات البرمجيات سهلة الاستخدام. فهو يمكّن الباحثين من استخدام التكنولوجيا المعاصرة في مختبرهم الخاص، من خلال الاستفادة من التعلم الآلي وقاعدة بيانات لنماذج التعبير الصحي لاشتقاق ملامح مناعية كمية أكثر دقة للعينات السريرية الثمينة، واكتشاف المؤشرات الحيوية المتعددة الأبعاد للحمض النووي الريبي مع التحليل الإحصائي الكامل.

<table><tbody><tr><td>0.2 مل PCR 8 شريط أنبوب</td><td>الولايات المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>1402-2700</td><td>الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 0.2 مل PCR 8 أنابيب شريط</td></tr><tr><td>200 دليل على الإيثانول</td><td>MilliporeSigma</td><td>EX0276-1</td><td>تحضير 80٪ عن طريق الخلط بالماء الخالي من النوكلياز في يوم التجربة</td></tr><tr><td>96 بئر التدوير الحراري</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>حبات الشلل الصلبة القابلة للانعكاس (SPRI)</td><td>بيكمان</td><td>كولتر A63882</td><td>Agencourt AMPure XP & ndash ؛ حبات تنقية PCR</td></tr><tr><td>رقائق ومجموعة الرحلان الكهربائي الرقمية</td><td>Agilent</td><td>Technologies 5067-4626</td><td>رقائق ومجموعة الحمض النووي عالية الحساسية Agilent</td></tr><tr><td>نظام الرحلان الكهربائي الرقمي</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Agilent 2100 Electrophoresr Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65306</td><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td></tr><tr><td>ImmunoPrism Kit & ندش. 24 تفاعل</td><td>Cofactor Genomics</td><td>CFGK-302</td><td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit & 24 تفاعلا</td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15279011</td><td>Invitrogen العلامة التجارية</td></tr><tr><td>رف الفصل المغناطيسي</td><td>Alpaca /</td><td>Invitrogen A001322 / 12331D</td><td>96-well حامل الحلقة المغناطيسية Micro</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الولايات</td><td>المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>1415-2600</td><td>الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق منخفض الالتصاق</td></tr><tr><td>NextSeq550</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>يمكن استخدام أي جهاز تسلسل Illumina لهذا البروتوكول</td></tr><tr><td>مياه خالية من Nuclease</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة استخراج المنشور</td> العامل <td>المساعد الجينوم</td><td>CFGK-401</td><td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit & ندش. 24 عينة</td></tr><tr><td>من الحمض النووي الريبي المنقى</td> <td>-</td><td></td> <td>منقى من عينات الأنسجة البشرية</td></tr><tr><td>مقياس الفلور</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td>Qubit 4 System</td></tr><tr><td>أنابيب الفحص الفلورومترية</td><td>Axygen</td><td>PCR-05-C</td><td>0.5 مل أنابيب PCR رقيقة الجدار مع أغطية مسطحة مجموعة</td></tr><tr><td>كاشف الفلورومتري عالية الحساسية</td><td>تقنيات الحياة</td><td>Q32854</td><td>كيوبت dsDNA HS مجموعة</td></tr> <tr><td>الفحصمكثف الفراغ</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>VacufugePlus</td></tr><tr><td>خلاط دوامة</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>حمام مائي أو كتلة تسخين</td><td>VWR / الولايات المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>NA / 2510-1102</td><td>VWR حمام مائي / الولايات المتحدة الأمريكية كتلة التدفئة العلمية</td></tr></tbody></table>

النمذجة المناعية التنبؤية للأورام الصلبة

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

تظهر العلاجات المناعية وعدًا في علاج مرضى الأورام ، ولكن التغايرية المعقدة للبيئة الدقيقة للورم تجعل التنبؤ باستجابة العلاج أمرًا صعبًا. وقد ثبت أن القدرة على حل التجمعات النسبية للخلايا المناعية الموجودة في وحول أنسجة الورم ذات صلة سريرية بفهم الاستجابة ، ولكنها محدودة بالتقنيات التقليدية مثل قياس التدفق الخلوي والكيمياء المناعية ( المدينة العالمية للخدمات الإنسانية)، نظرا لكمية كبيرة من الأنسجة المطلوبة، وعدم وجود علامات دقيقة نوع الخلية، والعديد من العقبات التقنية واللوجستية. واحد من الاختبارات (على سبيل المثال، والمناعية المناعة التنميط الاختبارات) يتغلب على هذه التحديات من خلال استيعاب كل من كميات صغيرة من الجيش الملكي النيبالي والحمض النووي الريبي المتدهورة للغاية، والسمات المشتركة للحمض النووي الريبي المستخرجة من الأنسجة الورم الصلبة المحفوظة سريريا. يتم الوصول إلى الاختبار من خلال مجموعة عوامل الكاشف والمعلوماتية المستندة إلى السحابة التي توفر حلًا كميًا عالي الإنتاجية للتنميط المناعي لمنصات تسلسل Illumina. يبدأ الباحثون ببضعة أقسام قليلة من البارافين المثبتة المثبتة (FFPE) الأنسجة أو 20-40 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي (اعتمادا على جودة العينة)، والبروتوكول يولد تقرير الشخصية المناعية تحديد ثمانية أنواع الخلايا المناعية والهروب المناعي عشرة الجينات ، والتقاط وجهة نظر كاملة من microenvironment الورم. ولا يلزم إجراء تحليل إضافي للمعلوماتية الحيوية للاستفادة من البيانات الناتجة. مع الأفواج عينة المناسبة، يمكن أيضا استخدام البروتوكول لتحديد المؤشرات الحيوية ذات دلالة إحصائية ضمن السكان المرضى ذات الأهمية.

هناك عدد من نقاط التفتيش في جميع أنحاء البروتوكول التي تمكن المستخدم من تقييم نوعية وكمية المواد التي تم إنشاؤها. بعد الخطوة 12 الموضحة في البروتوكول ، يتم إنشاء مخطط كهربي كما هو موضح في الشكل 3، ممثل مكتبة نموذجية قبل الالتقاط لعينة الحمض النووي الريبي سليمة (RIN = 7.8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> الشكل 3: نموذجي قبل التقاط مكتبة Bioanalyzer تتبع لعينة الحمض النووي الريبي سليمة. تظهر مكتبات ما قبل الالتقاط كذروة واسعة حول 250-400 زوج أساسي (bp) في الحجم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
وينبغي توخي الحذر لتجنب الإفراط في التضخيم، كما هو مبين في الذروة الثانية حول 1000 نقطة أساس كما هو مبين في الشكل 4، وهو مخطط كهربائي تمثيلي لمكتبة ما قبل الالتقاط تم إنشاؤها من عينة FFPE RNA (DV200 = 46). إذا كانت هذه الذروة صغيرة بالنسبة للذروة الرئيسية (حوالي 250-400 زوج أساسي (bp) ، كما هو موضح ) ، فإنها لن تتداخل مع الخطوات أو التحليل المصب. إذا كانت الذروة الثانية كبيرة بالنسبة إلى ذروة 250-400 bp ، يمكن إعادة صنع مكتبة ما قبل الالتقاط مع دورات أقل من PCR من أجل تقليل التضخيم.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> الشكل 4: نموذجي قبل التقاط مكتبة Bioanalyzer تتبع لعينة الجيش الملكي النيبالي FFPE. والذروة الثانية التي تبلغ حوالي 000 1 نقطة أساس تشير إلى الإفراط في التضخيم. إذا كانت هذه الذروة صغيرة بالنسبة للذروة الرئيسية حول 250-400 نقطة أساس (كما هو موضح)، فإنها لن تتداخل مع الخطوات أو التحليل المصب. إذا كانت الذروة الثانية كبيرة بالنسبة إلى ذروة 250-400 bp ، يمكن إعادة صنع مكتبة ما قبل الالتقاط مع دورات أقل من PCR من أجل تقليل التضخيم المفرط. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
كما هو موضح في الخطوة 12.1.3، يجب تقييم وجود أجهزة التميّل لتحديد ما إذا كان التنظيف الإضافي ضروريًا. المخططات الكهربائية الموضحة في الشكل 5 تمثل غير مقبول(الشكل 5A، DV200 = 33) ومقبولة(الشكل 5B، DV200 = 46) مستويات محول خافت ، تظهر كذروة حادة حول 128 نقطة أساس.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> الشكل 5: قبل التقاط مكتبة آثار Bioanalyzer. يظهر الديميتر المحول كذروة حادة حول 128 bp.(A)الخافتات المحولة المفرطة موجودة في هذا الرسم الكهربائي. (ب)يتم تصوير مستويات باهتة محول مقبولة في هذا التتبع. كلا آثار تظهر أدلة على التضخيم المفرط خفيفة، ولكن هذا لا ينبغي أن تتداخل مع اختبار ImmunoPrism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
عند الانتهاء من البروتوكول ، قبل التسلسل ، يتم تقييم المكتبات النهائية مرة أخرى باستخدام الكهربائي الرقمي. المكتبات المصنوعة من الجيش الملكي النيبالي FFPE تميل إلى أن يكون أصغر حجم التوزيع من المكتبات المصنوعة من الحمض النووي الريبي سليمة. بالنسبة لعينات الحمض النووي الريبي سليمة، يجب أن تبدو التتبع الناتج مشابهة للشكل 6 (RIN = 9.5). بالنسبة للحمض النووي الريبي المتدهور أو FFPE، يجب أن يبدو التتبع الناتج مشابهًا للرقم 7 (DV200 = 36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> الشكل 6: نموذجي المكتبة النهائية تتبع Bioanalyzer لعينة الحمض النووي الريبي سليمة. تظهر المكتبات النهائية كذروة واسعة حول 250-400 زوج أساسي (bp) في الحجم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> الشكل 7: نموذجي المكتبة النهائية تتبع Bioanalyzer لعينة FFPE RNA. المكتبات المصنوعة من الجيش الملكي النيبالي FFPE تميل إلى أن يكون أصغر حجم التوزيع من المكتبات المصنوعة من الحمض النووي الريبي سليمة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
كما هو موضح، يمكن تطبيق النتائج التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول بطريقتين رئيسيتين، كما هو موضح في الشكل 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> الشكل 8: حالتا استخدام للبروتوكول. يتم تطبيق النتائج الناتجة عن هذا التحليل التنميط المناعي في اثنين من التطبيقات الانتقالية الرئيسية. (أ)تبدأ حالة الاستخدام الأولى من أنسجة الورم الصلبة البشرية (بما في ذلك أرشيف FFPE) وتولد صورة مناعية فردية للعينة. (ب)بمجرد توليدها لمجموعة من العينات البشرية، يتم الجمع بين البيانات باستخدام بوابة المنشور لإنشاء علامة بيولوجية متعددة الأبعاد وتقرير العلامات البيولوجية المقابلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
ولتوضيح كل حالة من حالات الاستخدام هذه، يتم تضمين بيانات تمثيلية من دراسة تحويلية صغيرة21. العينات المستخدمة في هذه الدراسة هي مجموعة من العينات من 7 مرضى تم تشخيصهم وعلاجهم من سرطان الرئة غير صغير الخلية (NSCLC). العينات هي أنسجة الورم الصلبة المتطابقة مع المريض من خزعات ما قبل وبعد العلاج. أولاً، تم تحليل العينات الفردية لتوليد صورة مناعية، مثل تقرير المثال المبين في الشكل 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> الشكل 9: مثال تقرير المناعة الفردية لعينة NSCLC. يقوم خط أنابيب Prism Portal بإنشاء تقرير رسومي لكل عينة تتم معالجتها ، مع تقرير تمثيلي تم إنشاؤه لعينة ورم صلب من NSCLC موضح هنا. (أ)الجانب الأمامي من التقرير يصور بيانيا انهيار الخلايا المناعية الموجودة في عينة الحمض النووي الريبي المستخرجة من أنسجة FFPE. (ب)يتضمن الجانب العكسي من التقرير جدولًا بالخلايا المناعية (بالنسب المئوية المطلقة) والتعبير الجيني للهروب (في النصوص لكل مليون، أو TPM)، بالإضافة إلى بيان أداء للتحليل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يمكن استخدام الملامح المناعية قبل وبعد العلاج لفهم كيف قام العلاج (العلاج الكيميائي أو الإشعاعي ، في هذه الدراسة) بتعديل البيئة الدقيقة للورم. ويرد مثال في الشكل 10، حيث تظهر التغيرات في النسبة المئوية لكل خلية مناعية والمحتوى المناعي الكلي قبل وبعد العلاج الكيميائي ، لمريض واحد.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> الشكل 10: مثال نتائج ما قبل العلاج وما بعده. يتم عرض الخلايا المناعية الفردية وإجمالي بيانات المحتوى المناعي الناتجة عن عينات ما قبل وبعد العلاج من مريض واحد من NSCLC. في هذا المثال ، تلقى المريض نظام ًا كيميائيًا كعلاج. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يمكن تجميع المرضى حسب معايير مثل النتائج السريرية أو الأنماط الظاهرية للمقارنة. على سبيل المثال ، في الشكل 11، تمت مقارنة العينات في دراسة NSCLC وفقًا للوقت لتطور المرض بعد العلاج. وأظهرت مجموعة فرعية من المرضى تكرار المرض في أكثر من 18 شهرا، وتقدمت مجموعة فرعية أخرى بشكل أسرع، في ≤ 18 شهرا. تتم مقارنة قيمة الدلتا الوسيطة (الفرق بين قيم ما قبل العلاج وما بعده) لكل عينة لتحديد المؤشرات الحيوية المفترضة لتطور المرض.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> الشكل 11: مثال مقارنة النتائج السريرية. تم حساب التغيرات الكمية بين النسب المئوية للخلايا المناعية في عينات NSCLC المتطابقة قبل وبعد العلاج والإبلاغ عنها كقيمة "دلتا". تلك التي أبرزت في الأصفر تظهر تغييرات إشارة واضحة بين حالة البقاء على قيد الحياة. تمثل القضبان الزرقاء قيم دلتا متوسطة لمدة أكثر من 18 شهرًا حتى تطور المرض ، تمثل القضبان البرتقالية قيم دلتا متوسطة لمدة ≤ 18 شهرًا حتى تطور المرض. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
وأخيراً، يمكن استخدام مجموعات عينات مماثلة للنظر على وجه التحديد في عينات ما قبل المعالجة لتحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية باستخدام بوابة المنشور لإنشاء تقرير العلامات البيولوجية. كما هو موضح في الشكل 12، فإن نفس النمط الظاهري السريري (تطور المرض) كما هو موضح أعلاه يحدد مجموعات العينة. في هذا المثال، تم تحديد اثنين من جينات الهروب المناعي كتمييزات ذات دلالة إحصائية لتجمعات العينات (CD47 و OX40، كما هو موضح في اللوحة السفلية من الشكل 12A). في هذا المثال، لأن المؤشرات الحيوية للجين الفردية قوية ذات أهمية إحصائية واضحة، فإن العلامة الحيوية متعددة الأبعاد لا تضيف قيمة تنبؤية كبيرة (ImmunoPrism، كما هو مكتوب في المخطط الشريطي الأيمن العلوي للشكل 12B). ويُلخص الجدول الكامل للبيانات، بما في ذلك النتائج المتعلقة بجميع التحليلات الـ 18 للتحاليل، في الجانب العكسي من التقرير، بما في ذلك التحليل الإحصائي وموجز موجز للأساليب.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> الشكل 12: مثال تقرير العلامات البيولوجية لعينات NSCLC. يقدم خط أنابيب اكتشاف العلامات الحيوية تقريرًا مرئيًا للعلامات الحيوية الفردية ، وعلامة حيوية متعددة الأبعاد للتعلم الآلي ، مع إحصاءات مفصلة. (أ)لهذه الدراسة، حدد خط الأنابيب اثنين من المؤشرات الحيوية الفردية (CD47 و OX40) كإحصائية ذات دلالة لتحديد تطور المرض مع عتبة 18 شهرا. (ب)ترد تفاصيل عن الطريقة والنتائج الكاملة على الجانب العكسي من التقرير. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول التكميلي 1: مواد مجموعة مواد الكاشف. يتم سرد قائمة من المواد الواردة في مجموعة ImmunoPrism، جنبا إلى جنب مع أرقام الجزء المشار إليها في بروتوكول الشركة المصنعة. وترد جميع المعدات والمواد الأخرى المطلوبة في جدول المواد. زيارة <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> لأوراق بيانات السلامة (SDS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).</a>
الجدول التكميلي 2: برامج الدراجات الحرارية. يتم تلخيص برامج الدراجات الموصى بها المشار إليها في جميع أنحاء البروتوكول لسهولة البرمجة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).</a>
الجدول التكميلي 3: دليل مؤشر التسلسل. يتم سرد المؤشرات التمهيدية الفهرس المقدمة في مجموعة الكاشف; يتم إضافة التمهيدي فريدة من نوعها إلى كل رد فعل لdemultiplexing ما بعد التسلسل. كما يتم توفير مجموعات متعددة المستوى الموصى بها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).</a>

يتم وصف استخدام نهج قائم على الحمض النووي الريبي لتحديد الملامح المناعية الكمية لأنسجة الأورام الصلبة والاستفادة من الأتراب السريرية لاكتشاف العلامات الحيوية المناعية للأورام من خلال بروتوكولات الجزيئية والمعلوماتية.

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

إن توصيف بيئة الورم بشكل شامل أمر ضروري في أبحاث الأورام المناعية. هذا الفحص هو أول من يستخدم نماذج التعبير الصحي المستندة إلى الحمض النووي الريبي لقياس الخلايا المناعية في أنسجة الورم الصلبة. هذا الفحص تمكن الباحثين من الحصول على قياسات حساسة للغاية ومحددة من سياق المناعة في أنسجة الورم الصلبة FFB والجمع بين هذه النتائج في علامة حيوية متعددة الأبعاد.جميع علاجات السرطان، وليس فقط العلاجات المناعية، تثير استجابة مناعية في موقع الورم الصلب. قياس هذه الاستجابة المناعية مهم لفهم تطور المرض والاستجابات العلاجية. يجمع هذا البروتوكول بين تقنيات إعداد مكتبة RNA التقليدية مع الالتقاط المستهدف.في حين تستغرق وقتا طويلا، واتباع خطوات الغسيل ومراقبة نقاط التفتيش مراقبة الجودة على النحو المقترح مهم جدا للنجاح. بالنسبة لرنا المتحللة للغاية من عينات البارافين الثابتة ، قم بتجميع أول تفاعل توليفي على الجليد وفقًا للجدول. خلط ردود الفعل بدقة عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات قبل الغزل لفترة وجيزة أسفل العينات في microcentrifuge.في نهاية الطرد المركزي، ضع العينات على الفور في دورة حرارية مسخنة بعد البرنامج رقم ثلاثة من الجدول. بالنسبة للرنا السليم عالي الجودة، قم بتجميع أول تفاعل توليفي على الجليد في أنبوب PCR خال من النوى كما هو موضح في الجداول. لبدء هذا الإجراء، مزيج 200 نانوغرام من مكتبة ذات أهمية الباركود مع اثنين من ميكروغرام من الحمض النووي COT-1 واثنين من ميكرولترات من حجب oligos في أنبوب PCR خالية من النوى.ثم استخدام فراغ المكثف تعيين إلى 30 إلى 45 درجة مئوية لتجفيف محتويات الأنبوب. بعد التهجين، وإزالة العينات من دورة الحرارية وتعيين دورة الحرارية لاحتضان في 65 درجة مئوية مع غطاء ساخنة تعيين إلى 70 درجة مئوية. استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 17 ميكروليترس من الخرز متجانسة تماما إلى العينات وماصة جيدا صعودا وهبوطا 10 مرات.لربط الحمض النووي إلى الخرز، ووضع الأنابيب في دورة الحرارية بعد البرنامج 10 إزالة لفترة وجيزة الأنابيب جردت كل 10 إلى 12 دقيقة لمدة ثلاث ثوان من دوامة لطيف للحفاظ على حبات resuspended. مباشرة بعد حضانة ملزمة، وإزالة شريط واحد من الأنابيب من دورة الحرارية وإضافة 100 ميكرولترات من العازلة غسل مسخة مسبقا واحدة إلى الأنابيب. الماصات جيدا صعودا وهبوطا 10 مرات ووضع الأنابيب على رف المغناطيسي للسماح الخرز لفصل تماما عن محلول الغسيل قبل التعرق الحمض النووي غير منضم التي تحتوي على افراط.إزالة الأنابيب من الرف وإضافة 150 ميكروليترات من العازلة غسل صارمة مسخدة مع خلط شامل لإعادة ربط تماما الخرز مع الحرص على تجنب فقاعات. ضع الأنابيب مرة أخرى في الدورة الحرارية في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل وضع الأنابيب مرة أخرى على الرف المغناطيسي للسماح للخرز لفصل كامل عن اابر. تجاهل الحمض النووي غير منضم التي تحتوي على اغحام، وغسل الخرز مرة أخرى مع العازلة غسل صارمة مسخن كما أظهرت للتو لمجموع اثنين من يغسل صارمة.بعد الغسيل الأخير، وإزالة عظمى وإضافة 150 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة غسل العازلة واحدة إلى الأنابيب. Pipette غسل 10 إلى 20 مرة لإعادة تماما حبات واحتضان العينات مع غطاء مختومة لمدة دقيقتين بالتناوب بين دوامة لمدة 30 ثانية والراحة لمدة 30 ثانية. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي لفترة وجيزة ووضع الأنابيب على الرف المغناطيسي وإزالة فائقة مرة واحدة قد التزمت تماما الخرز إلى المغناطيس.أغلقت أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لفترة وجيزة مع قبعات مغلقة والعودة العينات إلى الرف المغناطيسي. استخدام ماصة 10 ميكروليتر لإزالة أي العازلة غسل المتبقية وإضافة 150 ميكروليتر من درجة حرارة الغرفة غسل العازلة اثنين. Pipette غسل 10 إلى 20 مرة لإعادة تعليق تماما الخرز واحتضان العينات مع الأغطية مختومة لمدة دقيقتين بالتناوب بين دوامة لمدة 30 ثانية والراحة لمدة 30 ثانية.بعد طرد مركزي قصير، قم بنقل كامل حجم الخرز من كل أنبوب إلى أنابيب PCR خالية من النيوكلازات النظيفة ووضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي. بعد التخلص من الحمض النووي غير المنضم الذي يحتوي على ملوثات فوقية ، طرد مركزي لفترة وجيزة العينات مرة أخرى واستخدام ماصة 10 ميكرولتر لإزالة أي عازلة الغسيل المتبقية من الخرز أثناء وجودهم في الرف المغناطيسي. إضافة 150 microliters من غسل العازلة ثلاثة إلى الأنابيب والماصات صعودا وهبوطا 10 إلى 20 مرة لإعادة ربط تماما الخرز.احتضان الأنبوب لمدة دقيقتين بالتناوب بين 30 ثانية من دوامة لطيف و 30 ثانية من الراحة قبل الطرد المركزي لفترة وجيزة. ضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي لpirate المابير والطرد المركزي لفترة وجيزة عينات الخرزة مرة أخرى. استخدام ماصة 10 ميكروليتر لإزالة أي عازلة غسل المتبقية من الخرز أثناء وجودهم في الرف المغناطيسي قبل إزالة الأنابيب من الرف وإعادة ربط الخرز في 20 ميكرولترات من المياه خالية من النوى لكل أنبوب.ثم الماصات الخرز 10 مرات لضمان أن أي حبات عالقة إلى جانب الأنابيب قد تم resuspended. يجب تقييم وجود خافمات المحول لتحديد ما إذا كان التنظيف إضافية ضروري. على سبيل المثال، يظهر هذا المخطط الكهربائي مستوى مقبول من خافض المحول الذي يظهر كذرية حادة حول أزواج قاعدة 128 بينما يظهر هذا المخطط الكهربائي مستوى غير مقبول من خافتر محول.يمكن استخدام ملفات تعريف المناعة قبل العلاج وما بعده لفهم آثار العلاج المحدد على البيئة الدقيقة للورم كما هو الحال في هذا التحليل التمثيلي الذي تظهر التغيرات في النسبة المئوية لكل خلية مناعية ذات فائدة والمحتوى المناعي الكلي قبل العلاج الكيميائي وما بعده لمريض واحد. في هذا التحليل، تم مقارنة العينات بين مجموعات المرضى وفقا لوقتهم لتطور المرض بعد العلاج. وأظهرت مجموعة فرعية من المرضى تكرار المرض بعد 18 شهرا في حين تقدمت مجموعة فرعية أخرى بشكل أسرع في 18 شهرا أو أقل.ويمكن بعد ذلك مقارنة قيمة دلتا الوسط لكل عينة لتحديد المؤشرات البيولوجية المفترضة لتطور المرض. على سبيل المثال، تم تحديد جينين مناعيين للهروب من الفئات على أنها مختلفة ذات دلالة إحصائية لمجموعات العينات. ولأن المؤشرات البيولوجية الجينية الفردية كانت قوية ذات أهمية إحصائية واضحة، فإن العلامة الحيوية المتعددة الأبعاد لم تضيف قيمة تنبؤية كبيرة.تأكد من إجراء غسلات ساخنة شريط واحد في وقت واحد لمنع تبريد العينة وتذكر لنقل الخرز إلى أنابيب جديدة لتجنب التلوث خارج الهدف. يوضح هذا البروتوكول استخدام نماذج التعبير الجيني لتحديد الخلايا المناعية والأنسجة السرطانية. ويجري حاليا وضع نماذج جديدة لقياس حالات الخلية مثل الإرهاق أو التنشيط.

predictive-immune-modeling-of-solid-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

يتم تقديم جيل من نموذج الفئران مثلي ورم المتوسطة الخبيثة الجنبي بواسطة زرع II-45 خلايا ورم الظهارة المتوسطة في التجويف الجنبي من الفئران المختصة المناعي. وهناك طريقة تدفق cytometric لتحليل سبع مجموعات فرعية الخلايا المناعية في هذه الحيوانات من عينة الدم 25 ميكرولتر يوصف أيضا.

مثلي زرع والأجهزة الطرفية المناعي رصد خلية في نموذج II-45 مسانج الجرذ ورم الظهارة المتوسطة

دراسة ورم المكروية يمكن تحديد المؤشرات الحيوية تشخيصية أو التنبؤي للاستجابة السريرية للعلاج المناعي. قدم هنا، هو طريقة مبتكرة تستند إلى في الموقع الأسفار المتعددة الأطياف التصوير لتحليل وحساب تلقائياً مختلف الفئات السكانية الفرعية من CD8+ تي الخلايا. هذا الأسلوب استنساخه وموثوق به مناسبة لتحليلات فوج كبير.

متعدد الفلورة التحليل والقياس الكمي ل Intratumoral PD-1+ CD8 تيم-3+ + تي الخلايا

ويهدف الإجراء التجريبي في إيمونوفينوتيبينج هوموجرافتس بدك أورثوتوبيك مورين التنميط وورم المكروية-المناعية. الأورام أورثوتوبيكالي مزروع عن طريق الجراحة. أورام من 200 – 600 مم3 في حجم حصاد وفصلها بإعداد تعليق خلية واحدة، متبوعاً بعلامة متعددة محصنة ضد نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل باستخدام الأجسام المضادة المختلفة المسمى فلوريسسينتلي.

إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي

هنا يصف لنا طريقة لفصل وإثراء مكونات من ورم المكروية محصنة وغير المتمتعين بالمناعة في أورام تحت الجلد الراسخة. يسمح هذا الأسلوب لتحليل منفصل من ارتشاح الورم المناعي والكسور الورم غير المتمتعين بالمناعة التي يمكن أن تسمح بتوصيف شامل لورم المكروية محصنة.

تخصيب اليورانيوم وتوصيف ميكرونفيرونمينتس المناعي والمناعة غير ورم في المنشأة الأورام مورين تحت الجلد

في عصر العلاج المناعي والتنميط الجينومي أحادي الخلية ، تتطلب بيولوجيا السرطان أدوات جديدة في المختبر وحسابية للتحقيق في واجهة الورم المناعية في سياق زماني مكاني مناسب. نحن نصف بروتوكولات لاستغلال الثقافات المشتركة للسوائع الدقيقة المناعية للورم في إعدادات 2D و 3D ، متوافقة مع المراقبة الديناميكية متعددة المعلمات للوظائف الخلوية.

نماذج الاستزراع المشترك للموائع الدقيقة لتشريح الاستجابة المناعية في البيئات الدقيقة للورم في المختبر

هنا ، نقدم بروتوكول زرع الورم لتوصيف الخلايا الليمفاوية المتأصلة في الورم والأطراف المشتقة من الورم في نموذج ورم الفئران. يكشف التتبع المحدد لتدفق الخلايا المناعية المشتقة من المتلقي باستخدام قياس التدفق الخلوي عن ديناميكيات النمط الظاهري والتغيرات الوظيفية لهذه الخلايا أثناء الاستجابات المناعية المضادة للورم.

زرع الورم لتقييم ديناميكيات الخلايا التائية CD8+ المتسللة للورم في الفئران

يقدم البروتوكول نموذجا للعلاج المناعي للسرطان باستخدام التطعيم ضد الورم القائم على الخلايا مع سرطان الجلد B16-F10 المعبر عن Flt3L. يوضح هذا البروتوكول الإجراءات ، بما في ذلك تحضير الخلايا السرطانية المستزرعة ، وزرع الورم ، وتشعيع الخلايا ، وقياس نمو الورم ، وعزل الخلايا المناعية داخل الورم ، وتحليل قياس التدفق الخلوي.

نموذج العلاج المناعي التجريبي للورم الميلانيني باستخدام التطعيم ضد الورم باستخدام السيتوكين المكونة للدم

يحدد هذا البروتوكول جيل فئران الجهاز المناعي البشري (HIS) لدراسات الأورام المناعية. يتم تقديم التعليمات والاعتبارات في استخدام هذا النموذج لاختبار العلاجات المناعية البشرية على الأورام البشرية المزروعة في هذا النموذج مع التركيز على توصيف استجابة جهاز المناعة البشري للورم.

اختبار العلاجات المناعية للسرطان في نموذج فأر متوافق مع البشر يحمل أوراما بشرية

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إجراء توصيف الخلايا المناعية للبيئة المكروية للورم باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة.

التحليل الكيميائي المناعي المتعدد لمشهد الخلايا المناعية المكانية للبيئة المكروية للورم

هنا ، نقدم طريقة لتحديد المركبات التي تعدل آلية ADCC ، وهي آلية مهمة لقتل الخلايا السرطانية للأجسام المضادة للأورام. يتم قياس التأثير السام للخلايا القاتلة الطبيعية في كرويات خلايا سرطان الثدي في وجود تراستوزوماب. يحدد تحليل الصور الخلايا القاتلة والمستهدفة الحية والميتة في الأجسام الكروية.

قياس السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة في نموذج كروي للورم: تطبيق لاكتشاف الأدوية

اكتشف طريقة قياس الملفات المناعية في الأورام الصلبة باستخدام نماذج التعبير الجيني القائمة على الحمض النووي الريبوزي. تساعد هذه التقنية الباحثين على فهم استجابات المناعة والتقدم المرضي.

النمذجة المناعية التنبؤية للأورام الصلبة

استكشف المزيد من الفيديوهات