اختبار العلاجات المستهدفة في السرطان باستخدام تحليل تعديل الحمض النووي الهيكلي وXenografts المستمدة من المريض
يوليو 25, 2020
هنا نقدم بروتوكول لاختبار فعالية العلاجات المستهدفة المختارة على أساس التركيبة الجينومية للورم. ويصف البروتوكول تحديد وإعادة التحقق من إعادة ترتيب الحمض النووي الهيكلي، وgragraftment من أورام المرضى في الفئران واختبار الاستجابات للأدوية المقابلة.
ويهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى إظهار خوارزمية لاختبار فعالية العلاج باستخدام نماذج سرطان الجسم الحي. يتكون البروتوكول من مزيج من عدة تقنيات. يتم استخدام التسلسل الحيوي للجينوم الكامل لعينات الورم البشري لتحديد التغيرات الجينومية.
وتشمل هذه كل من إعادة ترتيب الجينات وتغيرات رقم نسخة الجينات. لذلك يتم إجراء تحليل التعديلات المحددة من أجل تحديد التغييرات التي يمكن أن تكون قابلة لتخدرها. ثم يتم استخدام الأدوية المختارة استنادًا إلى التحليل الجينومي لعلاج الأورام ذات الصلة التي تزرع في الفئران المناعية.
تمثل الخوارزمية المطورة نهجًا واعدًا لمساعدة قرارات العلاج لرعاية مرضى السرطان. استخدم أداة Panda أو برنامج مشابه لتحديد التعديلات المستهدفة. يمكننا سرد الجينات التي تم تحديدها بواسطة microsequencing نتج عن ذلك كملف بسيط محدد بعلامة تبويب باستخدام رموز جينية قياسية مقبولة.
إضافة علامة الجنيه إلى خط الرأس من القائمة لضمان نقل رأس الجدول إلى مستوى المسار U من البرنامج. قم بتحميل الملف بالنقر على علامة التبويب التنقل المقابلة. تعيين رمز واحد لتمثيل البيانات الأساسية بالنقر فوق رمز الاختيار، ثم النقر فوق علامة التبويب إنهاء.
وبمجرد تحميل ملفات المريض، قم بمعاينة الصفحة لتحديد عمود يعرض عدد الجينات المشروحة لكل مسار. هذا هو العمود الأخير على اليمين. استخدم فلتر المسار في أعلى يسار النافذة الرئيسية لتقييد عدد المسارات المعروضة على المسارات التي تحتوي على الجينات ذات الأهمية.
لتحديد المسارات التي تحتوي على المزيد من الجينات المشروحة أكثر مما هو متوقع عن طريق الصدفة، استخدم وظيفة تقع تحت علامة التبويب التخصيب. ثم يتم إضافة عمود إلى الجدول الرئيسي الذي يظهر المقابلة قيمة ف من اختبار فيشر الدقيق. حدد قاعدة البيانات لعرض الجينات القابلة للتخجين المحتملة من التعليق التوضيحي المسبق مسبقًا عن طريق التحقق من رمز مناسب على يسار النافذة الرئيسية.
لتحديد مسار للتصور، انقر على اسمه المعروض في صفحة عارض المسار. يتم عرض الرموز التي تمثل كل مجموعة تعليقات توضيحية بجوار الجين المقترن. النقر على أي جين في المسار سوف تفتح صفحة بطاقات الجينات المقابلة.
حدد المسارات التي أظهرت الجينات المشروحة ذات الاهتمام والعقاقير المحتملة لمزيد من التحليل. إجراء عمل الأنسجة في غطاء تدفق لارينار للحفاظ على ظروف معقمة. وضع أنسجة الورم في طبق يحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة أو وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة، مثل دورة في الدقيقة، DMEM، التي تحتوي على المضادات الحيوية.
تحديد وعزل مواد الورم القابلة للحياة من الأنسجة الطبيعية والمخروخة المجاورة بمساعدة من أخصائي علم الأمراض. استخدام ملقط معقمة ومشرط لإزالة المواد النخرية التي أشار إليها أخصائي علم الأمراض. لأداء النقاب تحت الجلد، وقطع أنسجة الورم مع ملقط العقيمة، مشرط أو مقص الجراحية إلى شظايا صغيرة، ما يقرب من 2 × 2 × 2 ملليمتر في الحجم.
نقل الأنسجة المجزأة إلى طبق بتري مبردة مسبقا على الجليد. دع ماتريجل بارد في الطبق مع الأنسجة المجزأة ، ما يقرب من 200 ميكرولتر لكل 10 قطع من الأنسجة. تخلط جيدا والسماح لشظايا الأنسجة نقع في matrigel لمدة 10 دقائق.
استخدام مقص الجراحية المعقمة والملقط لجعل 5-10 ملليمتر شق الجلد العمودي على كلا الجناحين من الماوس. إدراج ملقط مستقيم بلطف في الفضاء تحت الجلد لإنشاء جيب كبير بما يكفي لشظايا الورم ليتم وضعها تحت وسادة الدهون. استخدام ملقط مستقيمة عقيمة لإدراج شظايا الورم في الجيب المعدة سابقا في كل من الفئران الخمسة.
أغلق شق الجلد باستخدام الغراء الأنسجة. بعد زرع, لمنع انتشار الخلايا الليمفاوية, حقن كل فأر مع 100 ميكرولترات من rituximab. إعداد الماوس لgavage عن طريق الفم عن طريق معسر الجلد من الظهر والانحناء إلى الوراء بحيث يتم شل الرأس والشفاه من الماوس.
أدخل مسبار الزلاجة أسفل الجزء الخلفي من حنجرة الماوس حتى يصل المسبار إلى المريء. تأكد من عدم إدراج المسبار بعيداً جداً لأن الرئتين من الماوس قد ثقب تسبب الموت. يوضح تعويم الجينوم التمثيلي المشهد الطبيعي للتغيرات الجينومية في ورم واحد.
نموذجي للأورام سيروسوبتيبي عالية الجودة، والخطوط الزرقاء المكاسب المتعددة والخسائر الخطوط الحمراء، تم تحديدها تشير إلى مستويات عالية من عدم الاستقرار الجينومي. وكان تغيير الاتجاه الأعلى للتدخل العلاجي في ورم OC101 هو التضخيم في الكروموسوم 17 ، الذي ينطوي على ERBB2 ، وهو جين رموز لمستقبلات HER2. للتحقق من صحة النتائج على مستوى الحمض النووي، تم تصميم عدة مجموعات من التمهيديات المحددة لحافات المنطقة المضخمة.
وتم تنفيذ PCR. لم يتم امتصاص أي منتج تضخيم عند استخدام الحمض النووي البشري التحكم. تم تحديد نطاقات محددة للحمض النووي الورم OC101.
في آخر الورم البديل، T14، لوحظ العديد من المكاسب الحمض النووي. وشملت تلك AKT2 في الجينات RIكتور. التحقق من صحة التي أجريت على مستوى البروتين، وذلك باستخدام مناعة أظهرت مستويات عالية من AKT في RICTOR.
لوحظ انخفاض كبير في عبء الورم في المجموعة العلاجية بحلول نهاية الأسبوع السادس. كان هناك فائدة إضافية على العلاج الكيميائي وحده في المجموعات التي تلقت العلاج الجمع. تم جمع أنسجة الورم للتحليل الجزيئي للاستجابة العلاجية في نهاية تجربة العلاج.
تم تحديد مستويات إجمالي وفسفورية من S6 و AKT و mTOR باستخدام مناعة. وأظهرت مقارنة مستويات هذه البروتينات في غير المعالجة، والعلاج الكيميائي، وعلاجها مع مثبطات AKT أو MTOR انخفاضا ملحوظا بالنسبة للاثنين الأخيرين. النهج المقدم مفيد جدا لإجراء التجارب السريرية في نماذج PDX.
وهو يستفيد من الخصائص الجزيئية للورم كما حصل عليه التنميط الجينومي لتحديد أفضل خيار من الأدوية للاختبار.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول خوارزمية لاختبار فعالية العلاجات الموجهة بناءً على التركيب الجينومي للأورام. ويتضمن ذلك تحديد إعادة ترتيبات الحمض النووي DNA الهيكلية وزرع أورام المرضى في الفئران لاختبار الاستجابة للدواء.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأورام
- علم الجينوم
- علم الأدوية
خلفية علمية
- يتم اختيار العلاجات الموجهة بناءً على التغيرات الجينومية.
- يمكن أن يساهم فهم إعادة ترتيب الحمض النووي DNA في تحديد خيارات العلاج.
- تعد النماذج الحية (In vivo) ضرورية لاختبار فعالية العقاقير.
- تُستخدم الفئران ناقصة المناعة لزراعة الأورام.
الغرض من الدراسة
- للتحقق من فعالية الأدوية المختارة من خلال التحليل الجينومي.
- لإنشاء بروتوكول للاختبار الحي (in vivo) للعلاجات الموجهة.
- لتعزيز فهم استجابات الأورام لعلاجات محددة.
الطرق المستخدمة
- التسلسل الحيوي للجينوم الكامل لعينات الأورام البشرية.
- تحديد التغيرات الجينومية، بما في ذلك إعادة ترتيب الجينات.
- اختيار التغيرات التي يمكن استهدافها علاجياً بناءً على التحليل.
- العلاج الحيوي للأورام في الفئران ناقصة المناعة.
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح لإعادة ترتيبات الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) الهيكلية.
- التحقق من فاعلية الأدوية المختارة في نماذج الفئران.
- إثبات فاعلية العلاج استناداً إلى التحليل الجينومي.
- فهم سلوك الورم استجابةً للعلاجات الموجهة.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول إطاراً لاختبار العلاجات الموجهة.
- يُعد التحليل الجينومي أمراً بالغ الأهمية لاختيار العلاجات الفعالة.
- تعتبر النماذج الحية (In vivo) ذات قيمة كبيرة لفهم الاستجابات الدوائية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول لفرق البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية تقييم العلاجات الموجهة باستخدام نماذج الطعوم الغريبة المشتقة من المرضى والمسترشدة بالتنميط الجينومي، مما يدعم اختيار الأدوية بناءً على الفرضيات والحد من المخاطر الميكانيكية في مرحلة التطوير قبل السريري. ومن خلال ربط التغيرات الهيكلية في DNA بالاستجابة الوظيفية للدواء، يعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف ويوجه قرارات المضي قدماً أو التوقف عن العلاجات المركبة. ويكتسب هذا النهج أهمية خاصة في الأورام التي تتسم بعدم استقرار جينومي عالٍ، حيث تفشل العلاجات القياسية ويُنظر في استخدام أدوية لأغراض غير مصرح بها.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استنطاق الفرضيات العلاجية من خلال ربط التغيرات التركيبية في DNA، مثل تضخيم الجينات وإعادة ترتيبها، بالأهداف القابلة للاستهداف الدوائي مثل ERBB2/HER2 و AKT2.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق الوظيفي من الأهداف داخل الجسم الحي باستخدام نماذج PDX، مما يقلل من الغموض الميكانيكي قبل مرحلة تحسين المركبات الرائدة.
- القيمة التنبؤية: تُظهر الارتباط بين التنبؤات الجينومية واستجابات الورم الملحوظة، مما يساعد في فرز محفظة المشاريع بناءً على الثقة في الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية تم التحقق من صحتها (نماذج PDX) ذات ملفات جينومية محددة لضمان تقييم موثوق للمركبات في عمليات الفحص اللاحقة.
- القيمة التشغيلية: توحيد بروتوكولات تطعيم الأورام والعلاج، مما يحسن قابلية التكرار عبر الدراسات المختلفة ويمكّن من إجراء اختبارات قبل سريرية قابلة للتوسع.
- جاهزية المقايسة: توليد قراءات جزيئية كمية (مثل phosphorylated S6 و AKT و mTOR) عبر تقنية immunoblotting لتقييم تثبيط المسار والاستجابة للعلاج.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يستخدم أوراماً مشتقة من المرضى للحفاظ على صلة المرض، مما يربط النتائج الجينومية من العينات البشرية بالنماذج الحية (in vivo).
- التحقق من الصحة قبل السريرية: يدعم قرارات التقدم المعدلة وفقاً للمخاطر من خلال إثبات خفض العبء الورمي وتأثيرات الأدوية النوعية للمسارات الحيوية في الجسم الحي (in vivo).
- تقليل مخاطر الآلية: يوضح ما إذا كانت الفعالية الملحوظة تعود إلى العلاج الأحادي أو العلاج المركب، مما يوجه تصميم التجارب السريرية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تدمج هذه الطريقة بين التحليل الجيني واختبار الفعالية في الجسم الحي، مما يضعها في مرحلة وسطى بين تحديد الهدف وتحسين الرصاص في سلسلة عملية الاكتشاف، وذلك لتمكين الانتقال القائم على البيانات إلى مرحلة التطوير قبل السريري.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال التحقق مما إذا كانت الجينات المعدلة هيكلياً قابلة للاستهداف دوائياً وظيفياً داخل الجسم الحي in vivo.
- الفحص: توفر نماذج PDX جاهزة للمقايسات ذات محركات جينومية معروفة، مما يتيح فحصاً موثوقاً للمركبات وتقييماً للعلاجات المدمجة.
- التحليلات: تقدم قياسات كمية للمتغيرات التابعة (العبء الورمي، فسفرة البروتين) والتي تسمح للفرق بمقارنة تأثيرات الأدوية وتقييم الارتباط بالهدف.
- الأبحاث الانتقالية: تحافظ على الاستمرارية من ورم المريض إلى النموذج قبل السريري، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية والنمذجة التنبؤية للاستجابة السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس سير عمل قابلاً لإعادة الاستخدام لاختبار العلاجات الموجهة عبر أنواع الأورام المختلفة، مما يقلل من تكرار تطوير النماذج.
الأثر التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تأكيد أن التغيرات على مستوى DNA تترجم إلى حساسية وظيفية للعقار داخل الجسم الحي (in vivo).
- القيمة التشغيلية: تعزيز إمكانية التكرار من خلال توحيد بروتوكولات معالجة الأنسجة، والزراعة، وإعطاء العقاقير.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين كفاءة رأس المال من خلال إعطاء الأولوية للأهداف التي أظهرت فعالية داخل الجسم الحي، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على محفظة المشاريع: تمكين ترتيب أولويات المرشحين من العقاقير بناءً على تعديل المخاطر، وذلك استناداً إلى التوافق بين التنبؤ الجينومي واستجابة نماذج PDX.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم الجينوم السرطاني، وعلم الأمراض، والنمذجة داخل الجسم لعزل أنسجة ورمية قابلة للحياة بدقة وتفسير التغيرات الجينومية.
- يعتمد على بنية تحتية لتسلسل الجيل القادم وأدوات المعلوماتية الحيوية (مثل أداة Panda) لتحليل التغيرات الهيكلية وإثراء المسارات.
- يستلزم إجراءات موحدة لتفتيت الورم بشكل معقم، والخلط مع Matrigel، والزراعة تحت الجلد لضمان نجاح عملية التطعيم.
- يتطلب قدرات في تحليل اللطخة المناعية لتقييم تعديل المسارات النهائية (مثل AKT/mTOR/S6) كمقاييس للديناميكا الدوائية.
- يتقيد بكثافة الوقت والموارد المطلوبة لإنشاء نماذج PDX، مما قد يحد من الإنتاجية في حملات الفحص واسعة النطاق.
