مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس

ويستخدم تسلسل مرنا خلية واحدة على نطاق واسع لفهم العمليات البيولوجية على مستوى خلية واحدة. وقد أدى ظهور استراتيجيات تعدد التضخيم إلى زيادة توسيع نطاق تضخيمها من خلال السماح بتحديد سمات عينات متعددة في تجربة واحدة، مما أدى إلى خفض التكلفة بشكل كبير وتجنب الآثار الدفعية. إثبات الإجراء سيكون وي فنغ، وهو ما بعد الدكتوراه، وأندرو Przysinda، وهو فني من مختبري.

بعد العد، وتقسيم الخلايا المعزولة من اليوم الجنيني 18.5 غرف القلب إلى خمس مرات 10 إلى aliquots الخامس وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل. Resuspend الكريات في 180 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل عينة وإضافة 20 ميكرولترات من الباركود مرساة حل الأسهم إلى كل أنبوب مع خلط لطيف. بعد حضانة لمدة خمس دقائق على الجليد، إضافة 20 ميكرولترات من الأسهم الباركود المشارك مرساة حل لكل أنبوب مع خلط لطيف لاحتضان إضافية لمدة خمس دقائق على الجليد قبل غسل الخلايا ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من PBS الباردة تكملها 1٪ بولين مصل لكل غسل، ثم تصفية العينات في أنابيب جديدة من خلال واحد مصفاة خلية 40 ميكرومتر لكل أنبوب.

بعد العد، وتجميع رقاقة B إلى حامل رقاقة، ثم إضافة 75 ميكرولترات من محلول 50٪ الجلسرول إلى الآبار غير المستخدمة في الصف واحد، 40 microliters إلى الآبار غير المستخدمة في الصف الثاني، و 280 ميكرولترات إلى الآبار غير المستخدمة في الصف الثالث. لاحظ أنه يتم استخدام شريحة تدريب هنا لشرح الإجراء. أضف الحجم المناسب من تعليق الخلية والمياه الخالية من النوى إلى المزيج الرئيسي مع الأنابيب اللطيفة.

إضافة 75 ميكرولترات من الحل الخلية الناتجة إلى مركز أسفل العينة جيدا في الصف واحد دون فقاعات. دوامة حبات هلام لمدة 30 ثانية قبل إضافة ببطء 40 ميكرولترات من الخرز إلى المركز السفلي من حبة هلام جيدا في الصف الثاني دون فقاعات. إضافة 280 microliters من تقسيم النفط أسفل الجدار الجانبي للزيت تقسيم بئر في الصف الثالث.

نعلق طوقا إلى رقاقة دون الضغط على طوقا والحفاظ على طوقا الأفقي لتجنب ترطيب طوقا. تحميل رقاقة تجميعها مع طوقا في وحدة تحكم الكروم وتشغيل الكروم خلية واحدة B البرنامج. لاحظ أن الشاشة يظهر الكروم التدريب لرقاقة التدريب ولكن للتجارب الحقيقية الشاشة سوف تعرض الكروم خلية واحدة B.When البرنامج قد أكملت، على الفور إزالة رقاقة وتجاهل طوقا.

أضعاف الغطاء مرة أخرى لفضح الآبار في زاوية 45 درجة والتحقق من مستويات السائل للتأكد من عدم وجود القباقيب. التعرق ببطء 100 ميكرولترات من حبات هلام في مستحلب من أدنى نقطة من الانتعاش جيدا والتحقق من توحيد الخرز. الاستغناء عن الخرز المستحلب أسفل جدار أنبوب PCR جديد على الجليد ووضع الأنبوب في دورة حرارية للنسخ العكسي.

لإعداد cDNA للتضخيم، إضافة 125 ميكرولترات من عامل الانتعاش إلى العينة في درجة حرارة الغرفة. لا ينبغي ملاحظة أي سائل مبهم وتجنب الأنابيب أو الدوامة. انتظر 60 ثانية قبل إزالة عامل الاسترداد ببطء من أسفل الأنبوب وإضافة 200 ميكرولترات من خليط تنظيف حبة الدوامة إلى العينة.

الميفط الخليط 10 مرات قبل احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، ضع العينات على مغناطيس في الموضع العالي. عندما يمسح الحل، وإزالة عظمى وإضافة 200 ميكرولترات من 80٪ الإيثانول إلى بيليه.

بعد 30 ثانية، وإزالة الإيثانول وكرر غسل مرتين أكثر. بعد الغسيل الأخير، طرد مركزي لفترة وجيزة العينة ووضع الأنبوب على المغناطيس في وضع منخفض للسماح للعينة للهواء الجافة لمدة تقل عن دقيقتين. عندما جفف العينة، وإزالة أنبوب من المغناطيس وإضافة 35.5 ميكرولترات من محلول elution الطازجة.

بعد فترة حضانة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ضع العينة على المغناطيس في وضعية عالية حتى يمسح المحل قبل نقل 35 ميكرولترات من العينة إلى شريط أنبوب جديد. بالنسبة لتضخيم cDNA باستخدام استراتيجية التكويد المستندة إلى الدهون ، أضف خليط تفاعل التضخيم إلى عينات cDNA ذات الـ 35 ميكرومتر مع خلط دقيق قبل الطرد المركزي لفترة وجيزة. في نهاية الدوران، احتضان العينة في دورة حرارية بعد إجراء التضخيم cDNA المناسبة.

إضافة 120 ميكرولترات من الكاشف مختارة و 100 ميكرولترات من المياه فائقة الpure إلى 100 ميكرولترات من العينة والماصات الناتجة 0.6x اختيار الكاشف 15 مرة. بعد فترة حضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ضع العينة على المغناطيس حتى يصبح الحل واضحًا. نقل supernatant إلى أنبوب الربط المنخفض 1.5 ملليلتر لإنشاء مكتبة cDNA الباركود multixing.

تذكر لحفظ كل من عظمى والقاعدة كما محتويات supernatant تجميع الباركود cDNA ومحتويات قاعدة cDNA الذاتية. تنظيف cDNA الذاتية مع 80٪ الإيثانول و elute الحمض النووي مع 40 ميكرولترات من عازلة elution، ثم تشغيل فحص مراقبة الجودة من cDNA الذاتية قبل إعداد مكتبة نسخة الذاتية. وينبغي تحديد كمية تركيزات ناو (cDNA) ونعتها قبل بناء المكتبة.

كما ينبغي تحديد كمي المكتبات التي تم بناؤها، بما في ذلك مكتبات cDNA المحلية ومكتبات الباركود، قبل ترتيبها. بعد التسلسل، يمكن تحليل التعبير الباركود في كل خلية واحدة. على سبيل المثال، في هذا التحليل، لوحظت ثماني مجموعات من الخلايا المفردة التي عبّرت بشكل فريد عن نوع واحد من الباركود الذي يمثل خلايا من ثماني عينات مختلفة.

بالإضافة إلى ذلك، لم تعبر بعض الخلايا عن أي الباركود وبالتالي تم تعريفها كخلايا سلبية، في حين عبرت خلايا أخرى عن شريطين باركود مختلفين يمثلان الزبلان. باستخدام الخلايا المفردة، يمكن تقييم التغاير الخلوي واللوائح الجزيئية حسب شرح نوع الخلية، وتحديد نوع الخلايا الجديد والنادرة، والتحليل المقارن للمنطقة التشريحية، وتحليل مسار علم الأنطولوجيا الجينية، مثل فصل مرحلة دورة الخلية. من المفيد أن تصور حبات الجل في مستحلب إذا كنت تستطيع ، حيث أن صورة ستخبرك ما إذا كان الإجراء قد نجح حتى هذه النقطة أم لا.

يضيف تعدد الالنماذج مرونة كبيرة في تصميم تجاربك. بعد مشاهدة هذه المظاهرة، آمل أن تكون أكثر ثقة حول بدء تجاربك الخاصة.