Name: تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: تعلم تحليل السكان الجانبية لعزل خلايا جذعية سرطانية من خطوط الخلايا الصلبة باستخدام تقنية Hoechst 33342. هذه الطريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لفهم خصائص الجذعية في الأورام.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد مولت هذا العمل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية 81572599 81773124 81972787؛ مؤسسة العلوم الطبيعية لمدينة تيانجين (الصين) 19JCYBJC27300؛ مستشفى تيانجين الشعبي وجامعة نانكاي منحة البحوث التعاونية 2016rmnk005; صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية، جامعة نانكاي 63191153.

1. إعداد الخلية
<ol><li>هضم الخلايا وإبطال هادأها<ol>
<li>خلايا ورم البذور (مثل خلايا MDA-MB-231) في لوحة بئر 6، وزراعة لهم في حاضنة 37 درجة مئوية الموردة مع 5٪ CO2.</li>
		<li>حصاد الخلايا عندما تصل كثافتها إلى حوالي 90٪. يستنشق ثقافة متوسطة جيدا ويغسل الخلايا 2x مع 3 مل من الفوسفات المالحة المخزنة (PBS). ملاحظة: لدراسة آثار مثبطات مسار الإشارات (على سبيل المثال، مثبط FRA1)، أو المنشطات (على سبيل المثال، المنشط STAT3) على ميزات الجذعية للخلايا السرطانية، تزرع الخلايا السرطانية في لوحة بئر 6 ويتم معالجتها مسبقا بمثبطات أو منشطات لفترة معينة من الوقت قبل الحصاد.</li>
		<li>أضف 500 ميكرولتر من 0.25٪ من التريبسين-EDTA إلى كل بئر من لوحة البئر 6، وضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق (دقيقة)، واضغط برفق على اللوحة لفصل الخلايا. ملاحظة: سيؤثر الهضم المطول على ملف تعريف SP بسبب التغييرات في صلاحية الخلية.</li>
		<li>إضافة 3 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 2٪ مصل البقر الجنيني (FBS) إلى كل بئر من لوحة بئر 6 لإنهاء الهضم وماصة بلطف الخلايا صعودا وهبوطا 3-5x لتفريق كتل الخلية.</li>
		<li>إضافة 0.5 مل من تعليق الخلية إلى بئر واحد من لوحة بئر 6 جديدة وفحصها تحت المجهر. إذا لوحظ تكتلات الخلايا، تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. ملاحظة: هذه خطوة اختيارية.</li>
		<li>نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. خلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه. إزالة supernatant وإعادة إنفاقها في 3 مل من برنامج تلفزيوني تكملها مع 2٪ FBS. ماصة الخلايا صعودا وهبوطا 3-5x لخلط جيدا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>عدد الخلايا<ol>
<li>أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق واخلطه مع محلول أزرق سعة 50 ميكرولتر. ماصة 10 ميكرولتر من الخليط لحساب عدد الخلايا الحية باستخدام طريقة قياسية، مثل مقياس الدم.</li>
		<li>تمييع الخلايا في برنامج تلفزيوني تكملها 2٪ FBS إلى تركيز نهائي من 1 × 106 خلايا / مل. إضافة 1 مل من تعليق الخلية إلى 5 مل البوليسترين جولة أنبوب الاختبار السفلي وإعداد اثنين من أنابيب العينة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. تلطيخ الخلية مع Hoechst 33342
<ol><li>إضافة Hoechst 33342 إلى أنبوب واحد للوصول إلى تركيز النهائي المناسب. ملاحظة: على سبيل المثال، التركيز المناسب من Hoechst 33342 هو 3 ميكروغرام/مل لخلايا MDA-MB-231.</li>
	<li>إضافة مانع (على سبيل المثال، Fumitremorgin C، فيراباميل، أو ريسربين) إلى أنبوب آخر إلى تركيز نهائي مناسب واحتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل إضافة نفس تركيز Hoechst 33342 كما هو موضح في الخطوة 2.1. ملاحظة: بالنسبة لخلايا MDA-MB-231، يكون مانع الصد المناسب Reserpine (40 ميكرومتر). Reserpine يستخدم كعنصر تحكم حظر للتحقق من عدم وجود خلايا في منطقة SP مسور.</li>
	<li>إعداد عدة أنابيب تحتوي على خلايا وإضافة Hoechst 33342 إلى تدرجات تركيز مختلفة. بعد فحص قياس التدفق الخلوي، اختر التركيز المناسب وفقا للملف الشخصي ونسبة SP. ملاحظة: هذه خطوة اختيارية تستخدم لتعريف التركيز الصحيح من Hoechst 33342.</li>
	<li>إعداد عدة أنابيب تحتوي على خلايا، إضافة مانع لتدرجات تركيز مختلفة، واحتضان الأنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم إضافة Hoechst 33342 إلى تركيز مناسب. بعد فحص قياس التدفق الخلوي، اختر التركيز المناسب وفقا لعدم وجود خلايا في منطقة SP المسورة. ملاحظة: هذه خطوة اختيارية تستخدم لتعريف التركيز الصحيح من مانع.</li>
	<li>ضع الأنابيب في حاضنة 37 درجة مئوية واحتضنها لمدة 60 دقيقة، وهز الأنابيب كل 10 دقائق. ملاحظة: يهز أنابيب جيدا مهم لتلطيخ، لأنه يضمن الاتصال الكامل بين الخلايا وصبغ للحصول على نتائج أفضل تلطيخ.</li>
	<li>بعد الحضانة، طرد الخلايا في 200 x g، 4 °C لمدة 5 دقائق، ونسيخ supernatant بعناية، لأن الخلايا تشكل الكريات فضفاضة جدا وغير مستقرة.</li>
	<li>Resuspend خلايا كل أنبوب في 1 مل من الجليد الباردة PBS تكملها مع 2٪ FBS وماصة الخلايا صعودا وهبوطا 3-5x لخلط جيدا. إضافة 1 ميكرولتر من 1 ملغم / مل البروبيديوم يوديد (PI) إلى تعليق كل أنبوب لتحديد الخلايا الميتة. ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات في هذه الخطوة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمنع ارتجاع Hoechst 33342 من الخلايا السرطانية. يجب حماية الأنابيب من التعرض المباشر للضوء.</li>
</ol>3. التحليل حسب قياس التدفق الخلوي
ملاحظة: إرشادات لاستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد)موضحة في هذا القسم والأرقام التكميلية 1-10.
<ol><li>في برنامج قياس التدفق الخلوي، انقر فوق الزر FOLDER . انقر فوق الزر تجربة، ثم انقر فوق تجربة جديدة (الشكل التكميلي 1A،B).</li>
	<li>انقر فوق الزر موافق. "Experiment_001" سوف تظهر تحت المجلد (الشكل التكميلي 2A،ب).</li>
	<li>انقر فوق الزر Experiment_001 لتغيير اسم المجلد إلى اسم محدد (على سبيل المثال، "20191118-SP"). انقر فوق إدخال. الاسم الجديد ("20191118-SP") سوف تظهر تحت المجلد (الشكل التكميلي 3A,B).</li>
	<li>انقر فوق الزر عينة جديدة لإضافة نموذج إلى مجلد التجربة الجديدة ("20191118-SP"). انقر فوق الزر أنبوب جديد لإضافة أنبوب إلى العينة. انقر فوق الزر Arrowhead (الشكل التكميلي 4A-C).</li>
	<li>انقر فوق الزر معلمات وإعداد معلمات مقياس التدفق الخلوي(الشكل التكميلي 5).<ol>
<li>استخدم مرآة 610 نانومتر قصيرة التمرير (DMSP) لفصل أطوال الموجة الانبعاثية. استخدام مرشح BP 450/20 نانومتر لجمع الفلورسينس الأزرق و675 نانومتر EFLP لجمع الفلورسينس الأحمر. ملاحظة: Hoechst 33342 متحمس مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية في 355 نانومتر وPI متحمس في 488 نانومتر.</li>
	</ol></li>
	<li>تشغيل عينات الخلية على مقياس التدفق الخلوي. ملاحظة: يمكن فرز خلايا SP حسب فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) في ظل ظروف معقمة. وينبغي جمع ما مجموعه 000 100 إلى 000 500 خلية لإجراء تجارب المتابعة.<ol><li>تشغيل الخلايا الملطخة Hoechst 33342 على تدفق الخلايا.<ol>
<li>ضع أنابيب تحتوي على خلايا ملطخة ب Hoechst 33342 على مقياس الخلايا.</li>
			<li>انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة ثم انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "PI-A". عرض مخطط النقطة لمنطقة النبض المبعثر الأمامي (FSC-A، المحور X الذي تم تعيينه إلى الوضع الخطي) مقابل مضان PI (مجموعة محور ص إلى مقياس لوغاريتمي). ضبط الفولتية لإظهار الخلايا الحية في الجانب الأيمن والخلايا غير الحية، والتي هي ملطخة الزاهية مع PI، في الزاوية اليسرى العليا. ثم قم بإنشاء بوابة مضلع لاستبعاد الخلايا الميتة وحطام الخلية(الشكل 1A)بالنقر فوق الزر بوابة المضلع لبوابة المجموعة الفرعية P1، والمعروفة أيضا باسم FSC-A، مجموعة فرعية PI-A (الشكل التكميلي 6A،B).</li>
			<li>انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة، انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "FSC-W". عرض رسم النقطة FSC-A (المحور X) مقابل عرض النبض المبعثر للأمام (FSC-W، محور ص). انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة، انقر فوق الزر P1 أسفل الزر إظهار المجموعات السكانية. انقر فوق الزر بوابة مستطيلة لإنشاء بوابة مستطيلة إلى بوابة المجموعة الفرعية P2 (يعرف أيضا FSC-A، FSC-W الفرعية). وهذا يستبعد الخلايا ذات الأحجام الكبيرة(الشكل التكميلي 7A-C والشكل 1A).</li>
			<li>انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "SSC-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "SSC-W". عرض رسم نقطة من ناحية النبض مبعثر الجانب (SSC-A، X-محور) مقابل عرض النبض مبعثر الجانب (SSC-W، Y-محور). انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة، وانقر فوق الزر P2 أسفل إظهار المجموعات السكانية. ثم انقر فوق الزر بوابة مستطيلة لإنشاء بوابة مستطيلة إلى بوابة المجموعة الفرعية P3 (يعرف أيضا باسم SSC-A، SSC-W الفرعية). وهذا سوف تحصل على السكان الخلية مع الحبيبية موحدة (الشكل التكميلي 8A-C والشكل 1A).</li>
			<li>انقر فوق الزر رسم نقطة لعرض رسم نقطة، انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "Hoechst الأحمر-A"; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى"Hoechst الأزرق-A". عرض رسم نقطة Hoechst الأحمر-A (المحور X) مقابل Hoechst الأزرق-A (المحور ص). انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة، انقر فوق الزر P3 أسفل الزر إظهار المجموعات السكانية. انقر فوق الزر بوابة المضلع لإنشاء بوابة مضلعة لبوابة المجموعة الفرعية P4 (تعرف أيضا باسم Hoechst Red-A، مجموعة فرعية Hoechst Blue-A). انقر بزر الماوس الأيمن فوق رسم النقطة، وانقر فوق الزر إظهار التسلسل الهرمي للسكان لإظهار التسلسل الهرمي للسكان. ملاحظة: سوف تظهر مؤامرة نقطة ثلاثة مجموعات مختلفة: 1) مجموعة G0-G1 المرحلة السكانية بالقرب من وسط الرسم البياني; 2) مجموعة من المراحل S-G2/M بالقرب من الزاوية اليمنى العليا؛ 3) SP. ثم يتم بوابة SP لمزيد من التحليل (الشكل التكميلي 9A-D والشكل 1A). إذا كانت مؤامرة نقطة Hoechst الأحمر ألف مقابل Hoechst الأزرق ألف لا تظهر لمحة عن SP مماثلة لتلك التي تظهر في الشكل 1A، وينبغي تعديل الفولتية حتى ينظر إلى ملف تعريف مماثل. وفي الوقت نفسه، ضبط جميع البوابات أعلاه وفقا لذلك.</li>
			<li>بعد تحديد منطقة بوابة خلايا SP، انقر فوق الحصول على البيانات لجمع أحداث 20,000-100,000 من كل عينة لتحليل النسبة المئوية لخلايا SP(الشكل التكميلي 10).</li>
		</ol></li>
		<li>تشغيل الخلايا الملطخة Hoechst 33342 تعامل مع مانع على مقياس التدفق الخلوي.<ol>
<li>ضع أنابيب تحتوي على مانع على مقياس الخلايا وتشغيل الخلايا باستخدام نفس الفولتية والبوابات لمزيد من التحقق مما إذا كان يتم اختيار الفولتية والبوابات بشكل مناسب. ملاحظة: بالمقارنة مع تلطيخ Hoechst 33342 وحده، يجب أن تظهر نسبة صغيرة جدا من الخلايا، إن وجدت، في المنطقة المسورة من SP (الشكل 1B).</li>
			<li>جمع الأحداث 20،000-100،000 من كل عينة لتحليل النسبة المئوية للخلايا SP.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. تحليل البيانات
ملاحظة: إرشادات لاستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد)موضحة في هذا القسم والأرقام التكميلية 11-16.
<ol><li>نسخ الملفات بتنسيق FCS إلى جهاز كمبيوتر، وفتح تدفق برنامج تحليل قياس الخلايا، واسحب ملف عينة واحدة إلى البرنامج (الشكل التكميلي 11A،B).
</li>
	<li>بوابة الخلايا والحصول على النسبة المئوية للخلايا SP.<ol>
<li>انقر نقرا مزدوجا فوق هذا الملف نموذج، انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC -A" ؛ انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "PI-A". ثم قم بإنشاء بوابة مضلع ثم انقر فوق الزر موافق للحصول على مجموعة فرعية FSC-A PI-A (الشكل التكميلي 12A-E).</li>
		<li>انقر نقرا مزدوجا فوق ملف مجموعة فرعية FSC-A، PI-A،انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "FSC-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "FSC-W". ثم قم بإنشاء بوابة مستطيلة ثم انقر فوق الزر موافق للحصول على FSC-A، FSC-W الفرعية (الشكل التكميلي 13A-E).</li>
		<li>انقر نقرا مزدوجا فوق ملف مجموعة فرعية FSC-A، FSC-W،انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "SSC-A" ؛ انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى "SSC-W". ثم قم بإنشاء بوابة مستطيلة ثم انقر فوق الزر موافق للحصول على مجموعة فرعية SSC-A SSC-W (الشكل التكميلي 14A-E).</li>
		<li>انقر نقرا مزدوجا فوق ملف مجموعة فرعية SSC-A، SSC-W،انقر فوق المحور X وتعيينه إلى "Hoechst Red-A" ; انقر فوق المحور ص وتعيينه إلى"Hoechst الأزرق-A". ثم قم بإنشاء بوابة مضلع وانقر فوق الزر موافق للحصول على Hoechst الأحمر-A، Hoechst الأزرق-A فرعية (الشكل التكميلي 15A-E).</li>
		<li>افتح محرر التخطيط بالنقر فوق الزر فتح محرر تخطيط. اسحب SSC-A، SSC-W ملف المجموعة الفرعية إلى محرر تخطيط، ثم انقر فوق انقر لحفظ نافذة التخطيط إلى ملف زر لحفظ نتائج الصورة(الشكل التكميلي 16A-C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>احفظ مساحة العمل للاحتفاظ بمعلومات gating عند إغلاق البرنامج.</li>
	<li>إجراء تحليلات t-test باستخدام برنامج التحليل الإحصائي لمقارنة الفرق بين مجموعتين. وقد عرفت قيمة P < 0.05 بأنها ذات دلالة إحصائية.</li>
</ol>

<ol><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li>
<li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2FCD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li>
<li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li>
<li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B+CD24%28-%29+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor%2Fstem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD90%2B+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li>
<li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology%3A+can+we+translate+into+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncolcology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16(2015).</li>
<li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+%28SP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18(2005).</li>
<li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells%3A+Beyond+Chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362(2017).</li>
<li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li>
<li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2%2FBCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li>
<li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp%2C+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li>
<li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+side+order+of+stem+cells%3A+the+SP+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li>
<li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+is+enriched+in+tumorigenic%2C+stem-like+cancer+cells%2C+whereas+ABCG2%2B+and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li>
<li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK2%2FSTAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44%28%2B%29CD24%28-%29+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li>
<li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Lead+to+Drug+Candidate%3A+Optimization+of+3-%28Phenylethynyl%29-1H-pyrazolo%5B3%2C4-d%5Dpyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicnal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li>
<li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li>
<li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+%28SP%29+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li>
<li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+the+side+population+%28SP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23(2013).</li>
<li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li>
<li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li>
<li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624(2019).</li>
<li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li>
<li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+%3A+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li>
<li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity%3A+A+Quantitative%2C+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188(2016).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li>
<li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li>
<li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li>
<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%22side+population%22+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+minor+groove-binding+ligands%3A+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li>
</ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

هناك العديد من النقاط الرئيسية التي يجب وضعها في الاعتبار لإجراء فحص SP. الأول هو اختيار مانع مناسب، مثل فيراباميل أو ريسربين، لكل خط خلية، لأنه يتم تحديد موقع "بوابة" من خلايا SP وفقا للموضع الذي يختفي فيه عدد كبير من خلايا SP بعد إضافة مانع. لخط الخلية MDA-MB-231، Reserpine يعمل بشكل جيد. ومع ذلك، بالنسبة لخطوط الخلايا الأخرى، قد تعمل حاصرات مختلفة بشكل أفضل.
والثاني هو تركيز Hoechst 33342. زادت النسبة المئوية لخلايا SP مع انخفاض تركيز التلطيخ في Hoechst 33342 ، كما أظهرت البيانات التمثيلية....

الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي مجموعات فرعية من الخلايا ذات القدرة على التجديد الذاتي وإمكانات التمايز المتعددة ، والتي تلعب دورا حيويا في نمو الورم ، والانبثاث ، وتكرار1،2. حاليا، تم تحديد CSCs أن تكون موجودة في مجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة، بما في ذلك الرئة والدماغ والبنكرياس والبروستاتا والثدي وسرطان الكبد3و4و5و6و7و8و9. ويستند تحديد CSCs في هذه الأورام أساسا على وجود البروتينات علامة السطح، مثل التعبير عالية و / أو منخفضة من CD44، CD24، CD133، وSca-19،10،ولكن لم يتم الإبلاغ عن علامة فريدة من نوعها التي يمكن أن تميز CSCs من غير CSCs حتى الآن. حاليا، يتم استخدام العديد من التقنيات لتحديد وتنقية CSCs في الأنسجة السرطانية أو خطوط الخلايا السرطانية. تم تصميم هذه التقنيات استنادا إلى خصائص محددة من CSCs. من بينها، المقايسات وفرز الخلايا الجانبية (SP) هي اثنين من الطرق الشائعة الاستخدام.
تم اكتشاف خلايا SP في الأصل من قبل Goodell وآخرون.11، عندما وصفت الخلايا الجذعية الدموية في خلايا نخاع العظم الماوس. عندما وصفت خلايا نخاع العظم الماوس مع صبغة الفلورسنت Hoechst 33342، ظهرت مجموعة صغيرة من الخلايا Hoechst 33342 ملطخة بشكل خافت في مؤامرة نقطة ثنائية الأبعاد من فحص قياس التدفق الخلوي. Hoechst 33342 هو صبغة الحمض النووي ملزمة ولها ما لا يقل عن وضعين ملزمة التي تؤدي إلى خصائص طيفية مختلفة. عند عرض انبعاث الفلورسينس على طولين موجيين في نفس الوقت ، يمكن الكشف عن مجموعات سكانية متعددة12. في المقايسة، كان متحمس Hoechst 33342 في 350 نانومتر، وقاست مضان باستخدام 450/20 نانومتر تمرير النطاق (BP) مرشح و675 نانومتر حافة مرشح تمريرة طويلة (EFLP)11. بالمقارنة مع مجموعة كاملة من خلايا نخاع العظام، تم إثراء هذه المجموعة من الخلايا مع الخلايا الجذعية الدموية تسمى خلايا SP11. خلايا SP قادرة على طرد Hoechst 33342 بسرعة. ويرتبط efflux من هذه الصبغة إلى ATP ملزمة كاسيت (ABC) الناقلات13, والتي يمكن أن تمنع من قبل بعض وكلاء مثل Fumitremorgin C14, فيراباميل وReserpine15,16. بعد ذلك ، تم الكشف عن نسب مختلفة من خلايا SP في مجموعة متنوعة من الأنسجة والأعضاء والأنسجة السرطانية وخطوط الخلايا السرطانية17و18و19. هذه الخلايا SP لها العديد من خصائص الخلايا الجذعية17،19.
تصف هذه المخطوطة هويشست 33342 وسم وتلطيخ الخلايا السرطانية المستزرعة وتحليل خلايا SP حسب قياس التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، يتم عرض الأمثل للتركيز Hoechst 33342 واختيار مانع السليم لخط خلية ورم محددة باستخدام هذا النهج. وأخيرا، يتم إثبات آثار تعزيز الجذعية أو إشارات التثبيط على نسبة SP في الخلايا السرطانية. وتبين الأمثلة التجريبية أنه يمكن استخدام تحليل SP لاستكشاف آثار إشارات مختلفة، مثل التعبير الجيني، ومثبطات صغيرة، والمفعلات، والسيتوكينات، وchemkines، على جذع الورم. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لعزل وتنقية CSCs ، مثل فرز CD44+/ CD24- السكان ، وتحليل ألدهيد ديهيدروجيناز (ALDH) ، وأجهزة قياس تكوين مجال الورم ، فإن هذه الطريقة أسهل للتلاعب وفعالة من حيث التكلفة.

<table><tbody><tr><td>6 ألواح زراعة خلايا الآبار</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td>9.5 سم 2 (تقريبا)</td></tr> <tr><td>Colivelin</td><td>MCE</td><td>HY-P1061A</td><td>Ser-ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-arg-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنينية (FBS)الصناعات</td> <td>البيولوجية (BIOIND)</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>مقياس التدفق الخلوي</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD LSRبرنامج</td></tr><tr><td>مقياس التدفق</td> الخلوي <td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSبرنامج</td></tr><tr><td>تحليل قياس التدفق</td> الخلوي <td>BD Biosciences</td><td></td><td>FlowJo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>bisBenzimide H 33342 ثلاثي هيدروكلوريد</td></tr><tr><td>البوليسترين أنبوب اختبار القاع</td><td>المستدير CORNING</td><td>352054</td><td>12 × 75 مم ، 5 مل</td></tr><tr><td>بروبيديوم يوديد (PI)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>P4170</td><td>3،8-ديامينو -5- [3- (ثنائي إيثيل ميثيل أمونيو) بروبيل] -6-فينيل فينانثريدينيوم ثنائي يوديد</td></tr><tr><td>ريسيربين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>83580</td> <td>(3 & بيتا ؛ ، 16 & بيتا ؛ 17 & ألفا ؛ 18 & بيتا ؛ 20 & ألفا ؛)-11،17-Dimethoxy-18- [(3،4،5-trimethoxybenzoyl)oxy] yohimban-16-carboxylic acid</td></tr><tr><td>methyl ester SKLB816</td><td>مقدمة من الدكتور Shengyong Yang ، جامعة</td><td></td><td></td>سيتشوان</tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمر</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>فيراباميل هيدروكلوريد</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>V4629</td><td>5- [N-(3،4-Dimethoxyphenylethyl) methylamino]
-2- (3،4-ثنائي ميثوكسي فينيل) -2-إيزوبروبيل فاليرونتريل هيدروكلوريد</td></tr></tbody></table>

تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي سبب مهم لنمو الورم، والانبثاث، وتكرار. عزل وتحديد CSCs ذات أهمية كبيرة لأبحاث الأورام. حاليا، وتستخدم عدة تقنيات لتحديد وتنقية CSCs من الأنسجة السرطانية وخطوط الخلايا السرطانية. فصل وتحليل خلايا السكان الجانبية (SP) هما من الطرق الشائعة الاستخدام. تعتمد الأساليب على قدرة CSCs على طرد الأصباغ الفلورية بسرعة ، مثل Hoechst 33342. ويرتبط efflux من الصبغة مع ناقلات كاسيت ATP ملزمة (ABC) ويمكن أن تمنعها مثبطات الناقل ABC. يتم وصف طرق تلطيخ الخلايا السرطانية المستزرعة مع Hoechst 33342 وتحليل نسبة خلايا SP الخاصة بهم عن طريق قياس التدفق الخلوي. هذا المقايسة مريحة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. يمكن أن تساهم البيانات التي تم إنشاؤها في هذا الفحص في فهم أفضل لتأثير الجينات أو الإشارات الأخرى خارج الخلية وداخل الخلايا على خصائص الجذعية للخلايا السرطانية.

وقد أجريت أربعة تحليلات تجريبية لسبو وفقا لهذه الطريقة. في أول واحد، اكتشفنا نسبة خلايا SP في MDA-MB-231، وهو خط خلايا سرطان الثدي البشري السلبي الثلاثي، في ظل الظروف العادية. بعد عد الخلايا، تمت إضافة Hoechst 33342 في أنبوب واحد يحتوي على 1 × 106 خلايا إلى تركيز نهائي قدره 3 ميكروغرام / مل. وأضيف ريسيربين وهويشست 33342 إلى أنبوب آخر إلى تركيزات نهائية تبلغ 40 ميكرومترا و3 ميكروغرام/مل على التوالي. تمت إضافة PI إلى كلا الأنبوبين. وأظهرت مؤامرة نقطة FSC-A (المحور السيني) مقابل PI-A (المحور ص) ثلاثة مجموعات السك...

يتم تقديم طريقة مريحة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لقياس نسبة الخلايا السكانية الجانبية في خطوط خلايا الورم الصلبة.

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

تحليل الخلايا السكانية الجانبية هي واحدة من الطرق الشائعة لعزل وتحديد الخلايا الجذعية السرطانية من الأنسجة السرطانية وخطوط الخلايا السرطانية. هذا المقايسة مريحة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. يمكن أن تساهم هذه الطريقة في فهم أفضل لتأثير الجينات أو غيرها من الإشارات خارج الخلية وداخل الخلايا على خصائص الجذعية للخلايا السرطانية.يمكن أن تؤثر العديد من العوامل على النسبة المئوية لخلايا SP في هذا التحليل ، لذلك من الأهمية بمكان استكشاف الظروف المناسبة قبل التجربة الرسمية. خلايا ورم البذور في لوحة من ستة آبار، واحتضانها في حاضنة 37 درجة مئوية الموردة مع ثاني أكسيد الكربون 5٪. عندما تصل كثافة الخلية إلى حوالي 90٪ يستنشق متوسط الثقافة، ويغسل الخلايا مرتين مع ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني.ثم، إضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA إلى كل بئر، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق. اضغط بلطف على لوحة لفصل الخلايا، إضافة ثلاثة ملليلترات من برنامج تلفزيوني تكملها مع 2٪ FBS إلى كل بئر، وماصة الخلايا صعودا وهبوطا ثلاث إلى خمس مرات لتفريق كتل الخلية. فحص تعليق الخلية تحت المجهر.إذا كانت كتل الخلية موجودة، مرر التعليق من خلال مصفاة 70 ميكرومتر. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر، والطرد المركزي لهم في 200 مرة غرام لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant، وإعادة إنفاق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني تكملها مع 2٪ FBS، pipetting الخلايا صعودا وهبوطا ثلاث إلى خمس مرات لخلط.عد الخلايا تحت المجهر باستخدام مقياس الدم، وتمييعها في برنامج تلفزيوني تكملها 2٪ FPS إلى تركيز نهائي من مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر. إعداد اثنين من خمسة ملليلتر، البوليسترين، جولة أسفل أنابيب الاختبار، وإضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل أنبوب. تسمية أنبوب واحد كما أنبوب اختبار والآخر كما أنبوب التحكم مانع.إعداد حل مانع عن طريق تمييعه إلى التركيز المناسب. إضافته إلى أنبوب التحكم مانع وتخلط جيدا، ثم احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هز الأنبوب كل 10 دقائق.إعداد حل Hoechst 33342 عن طريق تخفيفه إلى التركيز المناسب. إضافته إلى أنبوب الاختبار وانبوب التحكم مانع بشكل منفصل وتخلط جيدا، ثم احتضان الأنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. هز الأنابيب كل 10 دقائق.بعد الحضانة، طرد الخلايا لمدة خمس دقائق في 200 مرة ز وأربع درجات مئوية، ثم يستنشق بعناية supernatant. Resuspend الخلايا في كل أنبوب مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة PBS تكملها مع 2٪ FBS، ثم ماصة الخلايا صعودا وهبوطا لخلط. إضافة ميكرولتر واحد من واحد ملليغرام لكل ملليلتر بروديوم يوديد، أو PI، إلى كل أنبوب ومزيج.انقر فوق علامة التبويب معلمات في برنامج قياس التدفق الخلوي. أولا، اختر معلمات FSC وSSC و Hoechst Blue و Hoechst Red وPI على التوالي. ثانيا، اختر مقياس لوغاريتمي للمعلمة PI.وأخيرا، اختر مقياسي المساحة والعرض لمعلمات FSC وSSC وHoechst Blue وHoechst Red وPI على التوالي. تشغيل الخلايا من أنبوب الاختبار أولا، ثم تشغيل الخلايا من أنبوب التحكم مانع باستخدام نفس الفولتية والبوابات. جمع الأحداث 20 إلى 100،000 من كل عينة لتحليل النسبة المئوية للخلايا SP.تم استخدام هذه الطريقة للكشف عن نسبة خلايا SP في خط خلايا سرطان الثدي البشري MDA-MB-231. وأظهرت مؤامرة نقطة من FSC-A مقابل PI-A مجموعة من الخلايا الميتة، وحطام الخلايا، والسكان الرئيسيين للخلايا السلبية PI، والتي خضعت لمزيد من التحليل. تم استخدام مجموعة خلايا واحدة مسورة من مؤامرة نقطة FSC-A مقابل FSC-W ومؤامرة نقطة من SSC-A مقابل SSC-W لتحليل نسبة خلايا SP، والتي كانت حوالي 0.9٪ في الخلايا غير المعالجة وحوالي 0.09٪ في الخلايا المعالجة ب reserpine.تم اختبار تركيزات تلطيخ مختلفة من Hoechst 33342 على خلايا MDA-MB-435 ، وتقرر أن ميكروغرامين لكل ملليلتر كان الأمثل لتحليل SP. جعلت التركيزات المنخفضة من الصعب التمييز بين خلايا SP والسكان الآخرين، في حين تسببت التركيزات العالية في اختفاء خلايا SP. تم اختبار فيراباميل و ريسيربين لتحديد مانع المناسبة للخلايا MDA-MB-435.حوالي 0.4٪ من الخلايا طردت الصبغة بعد علاج فيراباميل، ولكن انخفضت النسبة إلى حوالي 0.1٪ بعد علاج ريسيربين، مما يدل على أن ريسيربين هو مانع أكثر ملاءمة لهذا الخط الخلوي. كما تم استخدام هذا البروتوكول لتحديد نسبة خلايا SP في خلايا سرطان الغدة الغدية الرئة البشرية A549 تعامل مع ستات3 المنشط colivelin وفي خلايا سرطان الثدي البشري T47D تعامل مع مثبط FRA1 SKLB816. يوفر هذا الفحص أدلة على التأثير التنظيمي لمسارات الإشارات على ميزات الخلايا الجذعية السرطانية ويسهل اكتشاف آليات جديدة ، والتي يمكن أن توجه في نهاية المطاف العلاج المستهدف للأورام.

analysis-of-side-population-in-solid-tumor-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

أبحاث السرطان

يصف البروتوكول التالي طريقة لعزل السكان الجانبيين للخلايا السرطانية لسرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية (T-ALL) ، والتي تتكون من خلايا جذعية ، من سمكة الزرد البالغة. تفتقر المجموعة الجانبية إلى علامات الخلايا البارزة ، وبالتالي نستخدم مقايسة تدفق الصبغة Hoechst 33342 لعزلها.

فحص السكان الجانبيين: طريقة لعزل السكان الجانبيين للخلايا السرطانية من أسماك الزرد

في هذا الفيديو ، نصف عزل مجموعة سكانية فرعية من الخلايا الجذعية السرطانية الشبيهة بالسرطان عن خطوط خلايا سرطان الحرشفية في الرأس والرقبة باستخدام فارز الخلايا المنشط بالفلورة أو FACS. يمكن استخدام المجموعة الجانبية المعزولة للخلايا لمزيد من التحليل النهائي.

مقايسة التمييز السكاني الجانبي للسرطان: طريقة لعزل الخلايا الجذعية الشبيهة بالسرطان باستخدام مقايسة Hoechst Dye Flows

تسهل التحليلات المتعمقة لبروتينات الخلايا السرطانية تحديد أهداف الأدوية الجديدة والمؤشرات الحيوية التشخيصية. نصف سير عمل تجريبي للتحليل الكمي للبروتينات (الفوسفو) في مجموعات الخلايا السرطانية الفرعية المشتقة من الأورام السائلة والصلبة. يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع بين استراتيجيات التخصيب الخلوي وقياس الطيف الكتلي الكمي القائم على Super-SILAC.

الكمي قداس الطيفية من التنميط Proteomes خلايا السرطان المستمدة من السائل والأورام الصلبة

أصبح فهم دور الخلايا الجذعية الشبيهة بالسرطان في تكرار الورم ومقاومة العلاجات موضوعا ذا أهمية كبيرة في العقد الماضي. توضح هذه المقالة عزل وتوصيف السكان الفرعيين للخلايا الشبيهة بالجذع السرطاني من خطوط خلايا سرطان الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC).

عزل وتوصيف من الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا حيوانية وجود الجذعية خصائص الخلية

الطرق التي تسمح بتوصيف وعزل السكان الخلايا الجذعية من العينات البيولوجية هي حاسمة لنهوض العلاجات المستهدفة الخلايا الجذعية في السرطان وما بعدها. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الجذعية السرطانية باستخدام النمط الظاهري الجانب الصبغة أثارت الصبغة.

تسخير الحمض النووي صبغ أثار الجانب السكان النمط الظاهري للكشف عن وتنقية الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البيولوجية

هنا، نحن تصف تقنية لعزل الخلايا السكان الجانب من نموذج الزرد من التي يسببها MYC T خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL). هذا الاختبار السكان الجانب حساس للغاية، ويوصف لالزرد T-ALL، لكنها قد تكون قابلة للتطبيق لأنواع الخلايا الزرد الخبيثة وغير الخبيثة الأخرى.

عزل السكان الجانب في الخلايا التائية التي يسببها ميك الخلايا اللمفاوية الحادة اللمفاوية في الزرد

قمنا بتطوير بروتوكول جديد لدراسة الديناميات السكانية غير المتجانسة في الاستجابة للاضطرابات. تصف هذه المخطوطة منصة تعتمد على التصوير تنتج مجموعات بيانات كمية لتوصيف في وقت واحد من المظاهر الخلوية متعددة من السكان غير المتجانسة بطريقة قوية.

التمييز وتوصيف السكان غير المتجانسة باستخدام تقنيات التصوير الكمي

هنا يصف لنا طريقة لفصل وإثراء مكونات من ورم المكروية محصنة وغير المتمتعين بالمناعة في أورام تحت الجلد الراسخة. يسمح هذا الأسلوب لتحليل منفصل من ارتشاح الورم المناعي والكسور الورم غير المتمتعين بالمناعة التي يمكن أن تسمح بتوصيف شامل لورم المكروية محصنة.

تخصيب اليورانيوم وتوصيف ميكرونفيرونمينتس المناعي والمناعة غير ورم في المنشأة الأورام مورين تحت الجلد

وصف الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) هو موضوع شائع في البحوث المترجمة. يصف هذا البروتوكول فحصًا شبه تلقائي للفلورة المناعية (IF) لتوصيف PD-L1 وتعداد CTCs في عينات المرضى من سرطان الرئة غير الصغيرة (NSCLC).

شبه التلقائي PD-L1 توصيف وتعداد الخلايا السرطانية المتداولة من غير الصغيرة خلية سرطان الرئة المرضى عن طريق الفلورة المناعية

النهج المقدم في وقت واحد يقيم غزو الخلايا السرطانية في 3D مقايسات كروية وT-خلية السمية الخلوية. يتم إنشاء Spheroids في جبيرة agarose متعددة microwell خالية من السقالات. يتم تنفيذ ثقافة المشاركة والتضمين في مصفوفة الكولاجين من النوع الأول داخل نفس الجهاز الذي يسمح بمراقبة غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية بوساطة T-cell.

رصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا T-Cell في الثقافة ثلاثية الأبعاد

هنا ، نظهر أن الليزر عالي الطاقة 375 نانومتر و 405 نانومتر يمكن أن يثير بشكل فعال Hoechst 33342 ويعمل كبديل قابل للتطبيق لليزر 355 نانومتر لاكتشاف خلايا السكان الجانبية (SP) ، وبالتالي توسيع نطاق الليزر المتاح في تطبيقات قياس التدفق الخلوي.

الكشف الفعال عن الخلايا السكانية الجانبية Hoechst عن طريق قياس التدفق الخلوي

تعلم تحليل السكان الجانبية لعزل خلايا جذعية سرطانية من خطوط الخلايا الصلبة باستخدام تقنية Hoechst 33342. هذه الطريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لفهم خصائص الجذعية في الأورام.

تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة

استكشف المزيد من الفيديوهات