تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة

تحليل الخلايا السكانية الجانبية هي واحدة من الطرق الشائعة لعزل وتحديد الخلايا الجذعية السرطانية من الأنسجة السرطانية وخطوط الخلايا السرطانية. هذا المقايسة مريحة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. يمكن أن تساهم هذه الطريقة في فهم أفضل لتأثير الجينات أو غيرها من الإشارات خارج الخلية وداخل الخلايا على خصائص الجذعية للخلايا السرطانية.

يمكن أن تؤثر العديد من العوامل على النسبة المئوية لخلايا SP في هذا التحليل ، لذلك من الأهمية بمكان استكشاف الظروف المناسبة قبل التجربة الرسمية. خلايا ورم البذور في لوحة من ستة آبار، واحتضانها في حاضنة 37 درجة مئوية الموردة مع ثاني أكسيد الكربون 5٪. عندما تصل كثافة الخلية إلى حوالي 90٪ يستنشق متوسط الثقافة، ويغسل الخلايا مرتين مع ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني.

ثم، إضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA إلى كل بئر، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق. اضغط بلطف على لوحة لفصل الخلايا، إضافة ثلاثة ملليلترات من برنامج تلفزيوني تكملها مع 2٪ FBS إلى كل بئر، وماصة الخلايا صعودا وهبوطا ثلاث إلى خمس مرات لتفريق كتل الخلية. فحص تعليق الخلية تحت المجهر.

إذا كانت كتل الخلية موجودة، مرر التعليق من خلال مصفاة 70 ميكرومتر. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر، والطرد المركزي لهم في 200 مرة غرام لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant، وإعادة إنفاق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني تكملها مع 2٪ FBS، pipetting الخلايا صعودا وهبوطا ثلاث إلى خمس مرات لخلط.

عد الخلايا تحت المجهر باستخدام مقياس الدم، وتمييعها في برنامج تلفزيوني تكملها 2٪ FPS إلى تركيز نهائي من مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر. إعداد اثنين من خمسة ملليلتر، البوليسترين، جولة أسفل أنابيب الاختبار، وإضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل أنبوب. تسمية أنبوب واحد كما أنبوب اختبار والآخر كما أنبوب التحكم مانع.

إعداد حل مانع عن طريق تمييعه إلى التركيز المناسب. إضافته إلى أنبوب التحكم مانع وتخلط جيدا، ثم احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هز الأنبوب كل 10 دقائق.

إعداد حل Hoechst 33342 عن طريق تخفيفه إلى التركيز المناسب. إضافته إلى أنبوب الاختبار وانبوب التحكم مانع بشكل منفصل وتخلط جيدا، ثم احتضان الأنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. هز الأنابيب كل 10 دقائق.

بعد الحضانة، طرد الخلايا لمدة خمس دقائق في 200 مرة ز وأربع درجات مئوية، ثم يستنشق بعناية supernatant. Resuspend الخلايا في كل أنبوب مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة PBS تكملها مع 2٪ FBS، ثم ماصة الخلايا صعودا وهبوطا لخلط. إضافة ميكرولتر واحد من واحد ملليغرام لكل ملليلتر بروديوم يوديد، أو PI، إلى كل أنبوب ومزيج.

انقر فوق علامة التبويب معلمات في برنامج قياس التدفق الخلوي. أولا، اختر معلمات FSC وSSC و Hoechst Blue و Hoechst Red وPI على التوالي. ثانيا، اختر مقياس لوغاريتمي للمعلمة PI.

وأخيرا، اختر مقياسي المساحة والعرض لمعلمات FSC وSSC وHoechst Blue وHoechst Red وPI على التوالي. تشغيل الخلايا من أنبوب الاختبار أولا، ثم تشغيل الخلايا من أنبوب التحكم مانع باستخدام نفس الفولتية والبوابات. جمع الأحداث 20 إلى 100،000 من كل عينة لتحليل النسبة المئوية للخلايا SP.

تم استخدام هذه الطريقة للكشف عن نسبة خلايا SP في خط خلايا سرطان الثدي البشري MDA-MB-231. وأظهرت مؤامرة نقطة من FSC-A مقابل PI-A مجموعة من الخلايا الميتة، وحطام الخلايا، والسكان الرئيسيين للخلايا السلبية PI، والتي خضعت لمزيد من التحليل. تم استخدام مجموعة خلايا واحدة مسورة من مؤامرة نقطة FSC-A مقابل FSC-W ومؤامرة نقطة من SSC-A مقابل SSC-W لتحليل نسبة خلايا SP، والتي كانت حوالي 0.9٪ في الخلايا غير المعالجة وحوالي 0.09٪ في الخلايا المعالجة ب reserpine.

تم اختبار تركيزات تلطيخ مختلفة من Hoechst 33342 على خلايا MDA-MB-435 ، وتقرر أن ميكروغرامين لكل ملليلتر كان الأمثل لتحليل SP. جعلت التركيزات المنخفضة من الصعب التمييز بين خلايا SP والسكان الآخرين، في حين تسببت التركيزات العالية في اختفاء خلايا SP. تم اختبار فيراباميل و ريسيربين لتحديد مانع المناسبة للخلايا MDA-MB-435.

حوالي 0.4٪ من الخلايا طردت الصبغة بعد علاج فيراباميل، ولكن انخفضت النسبة إلى حوالي 0.1٪ بعد علاج ريسيربين، مما يدل على أن ريسيربين هو مانع أكثر ملاءمة لهذا الخط الخلوي. كما تم استخدام هذا البروتوكول لتحديد نسبة خلايا SP في خلايا سرطان الغدة الغدية الرئة البشرية A549 تعامل مع ستات3 المنشط colivelin وفي خلايا سرطان الثدي البشري T47D تعامل مع مثبط FRA1 SKLB816. يوفر هذا الفحص أدلة على التأثير التنظيمي لمسارات الإشارات على ميزات الخلايا الجذعية السرطانية ويسهل اكتشاف آليات جديدة ، والتي يمكن أن توجه في نهاية المطاف العلاج المستهدف للأورام.