تحليل نفاذية حاجز الدم في الدماغ من قبل اجتياز الميكروبات من خلال الخلايا البوائية الدقيقة

هذه الطريقة تجعل من الممكن لتحليل حاجز الدم البشري في الدماغ عن طريق قياس الزفير البكتيري على العلاجات المختلفة. قد يساعد على اكتشاف التسبب في التهاب السحايا البكتيري والهذيان بعد الجراحة. بل هو طريقة واضحة ويتم تمثيل آثار العلاج مباشرة من قبل عدد من البكتيريا.

ويمكن تعديله لتمكين تحليل الإنتاجية العالية للمركبات على الخلايا البطانية. تبدأ من خلال تجميع لوحة 12-جيدا في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. فك لوحة وإدراج كل، ثم استخدام ملقط تعقيم للاستيلاء على إدراج في قاعدتهم ووضعها في الآبار.

معطف الغشاء المسامية من كل إدراج مع 90 ميكرولترات من 10 ميكروغرام لكل ميكروليت الكولاجين الرابع وخليط fibronectin واحتضان لوحة في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة، وغسل إدراج مرتين عن طريق pipetting ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في كل إدراج وpirating مع مضخة فراغ. ثم اصلح الأغشية عن طريق الأنابيب مسبقًا DMEM F12 المتوسطة في الغرف العلوية والسفلى واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لذرية الخلايا البطاخلية الدقيقة الأوعية الدموية البشرية، الاستنشاق المتوسطة من قارورة ثقافة الخلية وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. غطي الخلايا بالكامل بخمسة ملليلترات من التربسين EDTA وحضن القارورة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. نقل خمسة ملليلتر من الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر وإضافة خمسة ملليلتر من FCS تحتوي على المتوسطة لوقف التفاعل الأنزيمي.

الطرد المركزي تعليق لمدة ثلاث دقائق في 210 مرات ز، وإزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية في خمسة ملليلترات من المتوسط. إضافة 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى 10 ميكرولترات من 0.4٪ trypan وصمة عار زرقاء، ثم إضافة 10 ميكرولترات من الخليط إلى غرفة العد. ضع غرفة العد في عداد الخلايا وابدأ تشغيل البرنامج المناسب للتأكد من أن العداد مركز.

بعد العد، بذور 200،000 الخلايا في كل غرفة العليا على لوحة 12 جيدا واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 14 يوما تغيير وسائل الإعلام في الغرفة العليا والسفلى كل يومين إلى ثلاثة أيام. بعد 14 يوما، تأكد من أن التقاء الخلايا هو 100٪ عن طريق تصوير لهم مع المجهر. قبل يوم واحد من قياس نفاذية، وضعت مستعمرة واحدة من سلالة القولونية المعدلة وراثيا GM2163 في ثلاثة ملليلتر من متوسطة LB.

ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في شاكر حضانة. لعلاج الخلايا ذات مركّب من الفائدة، تميّع تركيزها النهائي في متوسط DMEM F12 وإضافة هذا الخليط إلى الغرف العلوية والسفلى في اللوحة 12-جيدا، ثم احتضان اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية. بعد الحضانة، تبادل المتوسطة كاملة مع المتوسطة خالية من المضادات الحيوية.

تحديد تركيز ثقافة البكتيريا بين عشية وضحاها من خلال قياس كثافتها البصرية في 600 نانومتر، ثم تمييعه إلى OD600 من 0.5 في أنبوب فالكون 50 ملليلتر. في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، إضافة 450 ميكرولترات من الحل البكتيري في كل غرفة عليا من لوحة 12-جيدا، ثم احتضان لوحة لمدة ست ساعات في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، وإزالة إدراج مع ملقط وعينة 50 ميكرولترات من المتوسط من كل غرفة سفلي مع الحرص على عدم تسرب المتوسطة من الغرف العليا إلى تلك السفلي.

من المهم الفصل بدقة بين وسائل الإعلام في الغرفة العليا والسفلى حيث أن امتداد البكتيريا من الغرفة العليا سيؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة. إسقاط كل عينة على لوحة أجار منفصلة و streak الحل مع موزع الخلية. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ثم عد المستعمرات.

للتحقيق في تأثير الجليس على الاعتياز الميكروبي من خلال حاجز الدم في الدماغ، تم علاج الخلايا مع 0.5 و 0.15 ميل غليوكسيكال ميليمولار لمدة ساعة واحدة مع الخلايا غير المعالجة التي تعمل كتحكم. ثم تم الكشف عن ال glycation عن طريق المناعة مع الأجسام المضادة للعضد. تم عد المستعمرات البكتيرية التي تم الحصول عليها وتمثيلها على أنها العدد المطلق للمستعمرات أو العدد النسبي للمستعمرات التي تم تطبيعها إلى عنصر التحكم.

وقد أظهرت العينات المعالجة بالجليوكسيال عدداً متزايداً من المستعمرات التي تشير إلى أن العلاج له تأثير على كثافة الحاجز الخلوي. وللتقصي عن الجلوكوز الناتج عن الجلوكوز، تم زراعة THBMECs في الجلوكوز العادي و متوسطة الجلوكوز العالية. العدد المطلق للمستعمرات والعدد النسبي للمستعمرات تطبيعها إلى السيطرة تشير إلى أن الجلوكوز لم يكن له تأثير كبير على سلامة حاجز الدم في الدماغ.

يمكن تحليل الخلايا البطانية المعالجة بمزيد من التحليل من خلال نهج البروتيوميات ، على سبيل المثال قياس الطيف الكتلي ، لتحليل التغيرات في البروتيوم. هذه التقنية تساعد في فهم حاجز الدم في الدماغ البشري والعابث البكتيرية. ويمكن استخدامه لاكتشاف جوانب الشيخوخة والأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر.