الجمع بين الأجهزة Fluidic مع المجهر والتدفق cytometry لدراسة النقل الميكروبي في وسائل الإعلام المسامية عبر المقاييس المكانية

دراسة نقل البكتيريا في نظم مسامية مهم فيما يتعلق بالتلوث، وانتشار الأمراض، والعلاج الحيوي. بالنسبة لهذه التجارب في النماذج الرياضية العاملة في الخلية الواحدة، يجب أن يكون السكان ومستوى المجتمع الميكروبي ضروريين. هنا نقدم أدوات لدراسة النقل البكتيري باستخدام الأجهزة المجهرية والمجهرية ، وكذلك الأجهزة الأكبر في تركيبة مع عملية استئصال الهواء.

يوفر الجمع بين الأجهزة الدقيقة ذات القياس المجهري والتدفقية مجموعة من الإمكانيات لدراسة ظواهر النقل البكتيرية على نطاقات مكانية مختلفة. من أجل استكشاف هذا البروتوكول بشكل كامل ، يقترح أن يكون لديك خبرة سابقة في المجهر ، ومعالجة الصور الأساسية ، وتصميم الأجهزة microfluidic ، واتقان قياس التدفق. يصف هذا الفيديو طريقتين لدراسة النقل البكتيري على نطاقات مكانية مختلفة.

تعتمد الطريقة الأولى ، القائمة على الأجهزة الدقيقة ، على المجهر لحساب الخلايا الفردية. ويمكن استخدام هذا النظام لدراسة النقل البكتيري عبر مقاييس مكانية متعددة من المسام إلى مقياس النظام المسامي بأكمله. أما الطريقة الثانية، التي تستخدم أجهزة سائلة أكبر حجماً مقرونة بالموزع الآلي وقياس التدفق، فيمكن استخدامها لدراسة ظاهرة النقل البكتيرية على نطاق نظم مسامية بالكامل.

ويمكن أيضاً استخدام هذه الأساليب في دراسات العمود على نطاق المختبرات، فضلاً عن الدراسات الاستقصائية الميدانية الصغيرة. للبدء ، تصميم الهندسة المسامية المطلوبة التي تتكون من مصفوفة من الدوائر. بناء على الهندسة المختارة، وإعداد قالب باستخدام معيار SU-8 التصوير الضوئي.

إعداد 50 غراما من PDMS عن طريق إضافة 90٪ من الداستومر إلى 10٪ من عامل علاج إلى 90٪ من الداستومر بالوزن في وعاء نظيف المتاح وخلط الكواشف اثنين مع أداة نظيفة. تطبيق فراغ 100 ملليبار لمدة 30 دقيقة لإزالة الهواء المذاب والفقاعات. ضع القالب في طبق بيتري وسكب PDMS على القالب إلى الارتفاع المطلوب بين اثنين وخمسة ملليمترات.

غطي طبق بيتري بغطاء وأبقيه على حرارة 60 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد ذلك، السماح للجهاز microfluidic لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد تبريده ، قم بإزالة الجزء المطلوب من PDMS بعناية باستخدام مشرط.

ختم مؤقتا الجزء السفلي من قناة PDMS مع الشريط. مع 0.5 ملليمتر قطرها اللكم، قنوات بيرس لإنشاء مدخل ومنفذ. قم بإزالة الشريط من قناة PDMS ووضع القناة مع الجانب المسامية التي تواجه لأعلى.

علاج الشريحة الزجاجية وأسطح PDMS مع البلازما لمدة 45 ثانية لكل من درجة حرارة الغرفة. ضع قناة PDMS المعالجة مسبقًا على الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقًا واسخني الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على لوحة ساخنة ، ثم قم بإزالة الجهاز microfluidic من اللوحة الساخنة وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة. تطبيق فراغ لمدة 30 دقيقة لإزالة الهواء من PDMS.

لإنتاج قاعدة تحتوي على حجرة المسام، استخدم طحن دقيق عالي الدقة لإزالة 0.5 ملليمتر من طبقة PMMA الأساسية وطحن أخدود بحجم 1.1 في 1.1 ملليمتر للحلقة O المطاطية. حفر اثنين من الثقوب مترابطة لمدخل ومنفذ في الجزء العلوي من الجهاز fluidic و 12 ثقوب للمسامير. هذا بمثابة غطاء الجهاز السائل.

بعد تنظيف الجهاز fluidic، المسمار القاعدة وغطاء معا باستخدام 12 الثقوب مترابطة. إزالة microfluidic من فراغ ووضعها على مرحلة المجهر. استخدام مضخة حقنة لتشبع مع العازلة الحركة.

باستخدام المجهر برايتفيلد أو النقيض المرحلة، وضبط التكبير لتصور الخلايا البكتيرية الفردية والتركيز على مركز قناة المراقبة. قم بتبديل إعدادات مسار الضوء إلى المجهر الفلوري. اضبط التركيز من خلال الإزاحة ووقت تعرض الكاميرا لحل الخلايا البكتيرية الفردية.

في هذه الحالة، 100 ميلي ثانية. بعد ذلك، أدخل أنابيب المدخل في أنبوب ملليلتر يحتوي على التعليق البكتيري. عكس اتجاه المضخة والبدء في سحب التعليق بمعدل تدفق من ميكرولتر واحد في الدقيقة الواحدة.

مسح المقطع المقطع من قناة المراقبة بأكملها، وتسجيل صورة كل دقيقة. استيراد الصور إلى منصة البرمجيات المطلوبة. تسجيل الخلفية كمتوسط للصور الأولى عندما لم يتم تسجيل أي جسيمات.

طرح الخلفية من كل صورة لإزالة الضوضاء الكاميرا والانحراف البصري. احصد الصور إلى منطقة ذات أهمية. تحديد قيمة عتبة تساوي كثافة بكسل الفلورانس الخلية بحيث تتضمن القيم الأكبر من العتبة الخلايا البكتيرية.

استخدم معالجة الصور لطرح قيمة العتبة من كل صورة. Binarize الصورة الناتجة بحيث تأخذ الخلايا البكتيرية قيمة واحدة ، في حين أن الخلفية تأخذ قيمة صفر. إزالة مجموعات من بكسل مع مساحة أصغر من أصغر حجم الخلية البكتيرية في بكسل.

جمع الصورة binarized للحصول على العدد الإجمالي للبكسل الكتل المتبقية. تقسيم عدد وحدات البكسل على متوسط حجم الخلية البكتيرية بالبكسل للحصول على تقدير لعدد الخلايا. تحويل العد إلى تركيز في الجسيمات لكل ملليلتر.

لتحديد تركيز التعليق البكتيري المحقون ، قم بحقن التعليق البكتيري في قناة المراقبة لجهاز دقيق نظيف مع حقنة. سجل الصورة وحساب تركيز البكتيريا المؤثرة كما هو مبين سابقا. تصور اختراق المنحنيات عن طريق تطبيع تركيز البكتيريا السائلة C مع تركيز البكتيريا المؤثرة C0 والتآمر C على C0 مقابل الوقت.

من أجل تحليل السرعات المحلية ومسارات البكتيريا المنقولة من خلال مصفوفة مسامية، نقل مرحلة المجهر إلى منطقة ذات أهمية وضبط التركيز على مركز الجهاز microfluidic. تعيين التكوين البصري على النقيض من المرحلة أو المجهر الفلوري. سجل الصور الفاصل الزمني ووقت التعرض قصيرة بما يكفي لالتقاط النزوح البكتيري.

في هذه الحالة، 50 ميلي ثانية. تسجيل الصور على مدى فترة كافية من الوقت، على سبيل المثال ثلاث دقائق. لإزالة الضوضاء من كل صورة، اطرح الخلفية، والتي هي متوسط مجموع جميع الصور المسجلة.

تحديد معامل التدرج العددي وتطبيعه بقيمته القصوى. البحث عن وتسجيل الإحداثيات البكتيرية ووقت الحصول على الصورة في ملف من ثلاثة أعمدة. إجراء تحليل تتبع الجسيمات لمعالجة البيانات المسجلة وحساب المسارات.

للحصول على ملامح ترسب، تسجيل صورة مركبة للقناة كامل مسامية من قبل، وهذا هو الخلفية، وبعد حقن تعليق بكتيرية من خلال الجهاز microfluidic. إزالة الخلفية من الصور المسجلة بعد الحقن البكتيري. حساب ملف تعريف الترسب D كمجموع إشارة الفلورسينس البكتيرية على طول الأجزاء العرضية من طول x من القناة المسامية.

تصور ملف تعريف الترسب كإشارة الفلورسنسي المحلية مقابل طول القناة المسامية. لإعداد موزع الآلي، ضع موزع الروبوتية على مقربة من الجهاز المائع. قم بتوصيل موزع الروبوتية بالكمبيوتر الذي يعمل على BCNC وحدد منفذ com الصحيح.

في BCNC، انقر فوق زر الصفحة الرئيسية لإرجاع موزع الروبوتية إلى موضع المنزل. توصيل مضخة ال peristaltic مع مدخل باستخدام 50 سنتيمترا طويلة، واحد ملليمتر أنابيب القطر الداخلي، وتدفق مع موزع الآلي باستخدام نفس الأنابيب. ضخ المتوسطة زراعة من خلال الجهاز سائل.

لاحظ وصول المتوسطة في أنابيب منفذ ثابت إلى موزع الروبوتية ووضع لوحة 96-well التي سوف تجمع تدفق. في الوقت نفسه، قم بتنشيط موزع الروبوتية وحقن التعليق البكتيري من خلال جهاز PMMA السائل بمعدل تدفق 0.2 ملليلتر في الدقيقة. حقن تعليق بكتيري يعادل عدة وحدات التخزين المسام.

على سبيل المثال، 30 ضعف حجم الجهاز المائع. بعد الحقن ، والتحول إلى زراعة وسيطة معقم حتى نهاية التجربة. بمجرد الانتهاء من لوحة 96-well، قم بتغطية اللوحة وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى تحليل قياس تدفق التحاليل.

تحليل العينات مع تدفق cytometry وتصور منحنيات اختراق عن طريق تطبيع تركيز البكتيريا السائلة C مع تركيز البكتيريا المؤثرة C0 والتآمر C على C0 مقابل الوقت. في هذه الدراسة، باستخدام كل من الكودين غير المتحركة الزائفة KT2440، أجريت تجارب متسلسلة في أجهزة microfluidic PDMS مع مجموعة عشوائية من الأعمدة. تظهر هنا منحنيات الاختراق التي تم تطبيعها إلى تركيز الخلايا المحقونة، وكذلك المسارات البكتيرية على مقياس المسام.

كما أجريت تجارب على أجهزة سائلة واسعة النطاق مُضروب من PMMA. تم حقن الـ (موتيل) و(Pseudomonas) غير المتحركة (البيدا KT2440) في مصفوفة مسامية متباعدة بانتظام. ومن اللافت للنظر، في بيئة مسامية خالية من بيو فيلم، كشفي وغير مويل Pseudomonas وضعية KT2440 أظهرت سلوك النقل مختلفة بشكل ملحوظ على أساس منحنيات اختراق.

في مصفوفة مسامية مستعمرة لمدة 48 ساعة مع مجتمع بيو فيلم تيار معقدة، اختفت هذه الاختلافات في منحنيات اختراق بين الضباب وغير موتي بسودوموناس putida KT2440. نحن نستخدم هذا النظام لدراسة النقل البكتيري في الجداول ، ولكن يمكن تعديل هذه الأدوات بسهولة لدراسة ظواهر النقل البكتيري في أنظمة أخرى هندسية وبيئية. ينقل البكتيريا عبر وسائل الإعلام المرطبة المسامية عمليات تغليف على نطاقات مكانية متعددة.

تسمح المنهجية المقدمة هنا بربط النزوح المحلي للبكتيريا على مقياس المسام بالنقل المجهري في الوسط المسامي بأكمله.