الجمع بين الأجهزة Fluidic مع المجهر والتدفق cytometry لدراسة النقل الميكروبي في وسائل الإعلام المسامية عبر المقاييس المكانية
November 25th, 2020
تعد منحنيات الاختراق (BTCs) أدوات فعالة لدراسة نقل البكتيريا في وسائل الإعلام المسامية. هنا نقدم الأدوات القائمة على الأجهزة المائعة في تركيبة مع المجهر والفرز تدفق cytometric للحصول على BTCs.
دراسة نقل البكتيريا في نظم مسامية مهم فيما يتعلق بالتلوث، وانتشار الأمراض، والعلاج الحيوي. بالنسبة لهذه التجارب في النماذج الرياضية العاملة في الخلية الواحدة، يجب أن يكون السكان ومستوى المجتمع الميكروبي ضروريين. هنا نقدم أدوات لدراسة النقل البكتيري باستخدام الأجهزة المجهرية والمجهرية ، وكذلك الأجهزة الأكبر في تركيبة مع عملية استئصال الهواء.
يوفر الجمع بين الأجهزة الدقيقة ذات القياس المجهري والتدفقية مجموعة من الإمكانيات لدراسة ظواهر النقل البكتيرية على نطاقات مكانية مختلفة. من أجل استكشاف هذا البروتوكول بشكل كامل ، يقترح أن يكون لديك خبرة سابقة في المجهر ، ومعالجة الصور الأساسية ، وتصميم الأجهزة microfluidic ، واتقان قياس التدفق. يصف هذا الفيديو طريقتين لدراسة النقل البكتيري على نطاقات مكانية مختلفة.
تعتمد الطريقة الأولى ، القائمة على الأجهزة الدقيقة ، على المجهر لحساب الخلايا الفردية. ويمكن استخدام هذا النظام لدراسة النقل البكتيري عبر مقاييس مكانية متعددة من المسام إلى مقياس النظام المسامي بأكمله. أما الطريقة الثانية، التي تستخدم أجهزة سائلة أكبر حجماً مقرونة بالموزع الآلي وقياس التدفق، فيمكن استخدامها لدراسة ظاهرة النقل البكتيرية على نطاق نظم مسامية بالكامل.
ويمكن أيضاً استخدام هذه الأساليب في دراسات العمود على نطاق المختبرات، فضلاً عن الدراسات الاستقصائية الميدانية الصغيرة. للبدء ، تصميم الهندسة المسامية المطلوبة التي تتكون من مصفوفة من الدوائر. بناء على الهندسة المختارة، وإعداد قالب باستخدام معيار SU-8 التصوير الضوئي.
إعداد 50 غراما من PDMS عن طريق إضافة 90٪ من الداستومر إلى 10٪ من عامل علاج إلى 90٪ من الداستومر بالوزن في وعاء نظيف المتاح وخلط الكواشف اثنين مع أداة نظيفة. تطبيق فراغ 100 ملليبار لمدة 30 دقيقة لإزالة الهواء المذاب والفقاعات. ضع القالب في طبق بيتري وسكب PDMS على القالب إلى الارتفاع المطلوب بين اثنين وخمسة ملليمترات.
غطي طبق بيتري بغطاء وأبقيه على حرارة 60 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد ذلك، السماح للجهاز microfluidic لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد تبريده ، قم بإزالة الجزء المطلوب من PDMS بعناية باستخدام مشرط.
ختم مؤقتا الجزء السفلي من قناة PDMS مع الشريط. مع 0.5 ملليمتر قطرها اللكم، قنوات بيرس لإنشاء مدخل ومنفذ. قم بإزالة الشريط من قناة PDMS ووضع القناة مع الجانب المسامية التي تواجه لأعلى.
علاج الشريحة الزجاجية وأسطح PDMS مع البلازما لمدة 45 ثانية لكل من درجة حرارة الغرفة. ضع قناة PDMS المعالجة مسبقًا على الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقًا واسخني الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على لوحة ساخنة ، ثم قم بإزالة الجهاز microfluidic من اللوحة الساخنة وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة. تطبيق فراغ لمدة 30 دقيقة لإزالة الهواء من PDMS.
لإنتاج قاعدة تحتوي على حجرة المسام، استخدم طحن دقيق عالي الدقة لإزالة 0.5 ملليمتر من طبقة PMMA الأساسية وطحن أخدود بحجم 1.1 في 1.1 ملليمتر للحلقة O المطاطية. حفر اثنين من الثقوب مترابطة لمدخل ومنفذ في الجزء العلوي من الجهاز fluidic و 12 ثقوب للمسامير. هذا بمثابة غطاء الجهاز السائل.
بعد تنظيف الجهاز fluidic، المسمار القاعدة وغطاء معا باستخدام 12 الثقوب مترابطة. إزالة microfluidic من فراغ ووضعها على مرحلة المجهر. استخدام مضخة حقنة لتشبع مع العازلة الحركة.
باستخدام المجهر برايتفيلد أو النقيض المرحلة، وضبط التكبير لتصور الخلايا البكتيرية الفردية والتركيز على مركز قناة المراقبة. قم بتبديل إعدادات مسار الضوء إلى المجهر الفلوري. اضبط التركيز من خلال الإزاحة ووقت تعرض الكاميرا لحل الخلايا البكتيرية الفردية.
في هذه الحالة، 100 ميلي ثانية. بعد ذلك، أدخل أنابيب المدخل في أنبوب ملليلتر يحتوي على التعليق البكتيري. عكس اتجاه المضخة والبدء في سحب التعليق بمعدل تدفق من ميكرولتر واحد في الدقيقة الواحدة.
مسح المقطع المقطع من قناة المراقبة بأكملها، وتسجيل صورة كل دقيقة. استيراد الصور إلى منصة البرمجيات المطلوبة. تسجيل الخلفية كمتوسط للصور الأولى عندما لم يتم تسجيل أي جسيمات.
طرح الخلفية من كل صورة لإزالة الضوضاء الكاميرا والانحراف البصري. احصد الصور إلى منطقة ذات أهمية. تحديد قيمة عتبة تساوي كثافة بكسل الفلورانس الخلية بحيث تتضمن القيم الأكبر من العتبة الخلايا البكتيرية.
استخدم معالجة الصور لطرح قيمة العتبة من كل صورة. Binarize الصورة الناتجة بحيث تأخذ الخلايا البكتيرية قيمة واحدة ، في حين أن الخلفية تأخذ قيمة صفر. إزالة مجموعات من بكسل مع مساحة أصغر من أصغر حجم الخلية البكتيرية في بكسل.
جمع الصورة binarized للحصول على العدد الإجمالي للبكسل الكتل المتبقية. تقسيم عدد وحدات البكسل على متوسط حجم الخلية البكتيرية بالبكسل للحصول على تقدير لعدد الخلايا. تحويل العد إلى تركيز في الجسيمات لكل ملليلتر.
لتحديد تركيز التعليق البكتيري المحقون ، قم بحقن التعليق البكتيري في قناة المراقبة لجهاز دقيق نظيف مع حقنة. سجل الصورة وحساب تركيز البكتيريا المؤثرة كما هو مبين سابقا. تصور اختراق المنحنيات عن طريق تطبيع تركيز البكتيريا السائلة C مع تركيز البكتيريا المؤثرة C0 والتآمر C على C0 مقابل الوقت.
من أجل تحليل السرعات المحلية ومسارات البكتيريا المنقولة من خلال مصفوفة مسامية، نقل مرحلة المجهر إلى منطقة ذات أهمية وضبط التركيز على مركز الجهاز microfluidic. تعيين التكوين البصري على النقيض من المرحلة أو المجهر الفلوري. سجل الصور الفاصل الزمني ووقت التعرض قصيرة بما يكفي لالتقاط النزوح البكتيري.
في هذه الحالة، 50 ميلي ثانية. تسجيل الصور على مدى فترة كافية من الوقت، على سبيل المثال ثلاث دقائق. لإزالة الضوضاء من كل صورة، اطرح الخلفية، والتي هي متوسط مجموع جميع الصور المسجلة.
تحديد معامل التدرج العددي وتطبيعه بقيمته القصوى. البحث عن وتسجيل الإحداثيات البكتيرية ووقت الحصول على الصورة في ملف من ثلاثة أعمدة. إجراء تحليل تتبع الجسيمات لمعالجة البيانات المسجلة وحساب المسارات.
للحصول على ملامح ترسب، تسجيل صورة مركبة للقناة كامل مسامية من قبل، وهذا هو الخلفية، وبعد حقن تعليق بكتيرية من خلال الجهاز microfluidic. إزالة الخلفية من الصور المسجلة بعد الحقن البكتيري. حساب ملف تعريف الترسب D كمجموع إشارة الفلورسينس البكتيرية على طول الأجزاء العرضية من طول x من القناة المسامية.
تصور ملف تعريف الترسب كإشارة الفلورسنسي المحلية مقابل طول القناة المسامية. لإعداد موزع الآلي، ضع موزع الروبوتية على مقربة من الجهاز المائع. قم بتوصيل موزع الروبوتية بالكمبيوتر الذي يعمل على BCNC وحدد منفذ com الصحيح.
في BCNC، انقر فوق زر الصفحة الرئيسية لإرجاع موزع الروبوتية إلى موضع المنزل. توصيل مضخة ال peristaltic مع مدخل باستخدام 50 سنتيمترا طويلة، واحد ملليمتر أنابيب القطر الداخلي، وتدفق مع موزع الآلي باستخدام نفس الأنابيب. ضخ المتوسطة زراعة من خلال الجهاز سائل.
لاحظ وصول المتوسطة في أنابيب منفذ ثابت إلى موزع الروبوتية ووضع لوحة 96-well التي سوف تجمع تدفق. في الوقت نفسه، قم بتنشيط موزع الروبوتية وحقن التعليق البكتيري من خلال جهاز PMMA السائل بمعدل تدفق 0.2 ملليلتر في الدقيقة. حقن تعليق بكتيري يعادل عدة وحدات التخزين المسام.
على سبيل المثال، 30 ضعف حجم الجهاز المائع. بعد الحقن ، والتحول إلى زراعة وسيطة معقم حتى نهاية التجربة. بمجرد الانتهاء من لوحة 96-well، قم بتغطية اللوحة وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى تحليل قياس تدفق التحاليل.
تحليل العينات مع تدفق cytometry وتصور منحنيات اختراق عن طريق تطبيع تركيز البكتيريا السائلة C مع تركيز البكتيريا المؤثرة C0 والتآمر C على C0 مقابل الوقت. في هذه الدراسة، باستخدام كل من الكودين غير المتحركة الزائفة KT2440، أجريت تجارب متسلسلة في أجهزة microfluidic PDMS مع مجموعة عشوائية من الأعمدة. تظهر هنا منحنيات الاختراق التي تم تطبيعها إلى تركيز الخلايا المحقونة، وكذلك المسارات البكتيرية على مقياس المسام.
كما أجريت تجارب على أجهزة سائلة واسعة النطاق مُضروب من PMMA. تم حقن الـ (موتيل) و(Pseudomonas) غير المتحركة (البيدا KT2440) في مصفوفة مسامية متباعدة بانتظام. ومن اللافت للنظر، في بيئة مسامية خالية من بيو فيلم، كشفي وغير مويل Pseudomonas وضعية KT2440 أظهرت سلوك النقل مختلفة بشكل ملحوظ على أساس منحنيات اختراق.
في مصفوفة مسامية مستعمرة لمدة 48 ساعة مع مجتمع بيو فيلم تيار معقدة، اختفت هذه الاختلافات في منحنيات اختراق بين الضباب وغير موتي بسودوموناس putida KT2440. نحن نستخدم هذا النظام لدراسة النقل البكتيري في الجداول ، ولكن يمكن تعديل هذه الأدوات بسهولة لدراسة ظواهر النقل البكتيري في أنظمة أخرى هندسية وبيئية. ينقل البكتيريا عبر وسائل الإعلام المرطبة المسامية عمليات تغليف على نطاقات مكانية متعددة.
تسمح المنهجية المقدمة هنا بربط النزوح المحلي للبكتيريا على مقياس المسام بالنقل المجهري في الوسط المسامي بأكمله.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة أدوات مبتكرة لدراسة نقل البكتيريا في الوسط المساميّ باستخدام الأجهزة المكروية، المجهر، وقياس تدفق الخلايا. تسمح هذه الطرق للباحثين بالتحقيق في ظاهرة النقل على مختلف المقاييس المكانية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- علم البيئة
- ديناميكا السوائل
الخلفية
- فهم نقل البكتيريا أمر بالغ الأهمية لمعالجة التلوث وانتشار الأمراض.
- هناك حاجة إلى نماذج رياضية لتحليل النقل على مستوى الخلية الواحدة والمجتمع.
- الأجهزة المكروية تعزز دراسة سلوك البكتيريا في بيئات خاضعة للرقابة.
- مزج المجهر وقياس تدفق الخلايا يوفر رؤى شاملة حول ديناميات البكتيريا.
هدف الدراسة
- تطوير أدوات لدراسة نقل البكتيريا في الأنظمة المسامية.
- استكشاف ظاهرة النقل على المقاييس المكانية المختلفة.
- توفير بروتوكول للباحثين ذوي الخبرة في المجهر وقياس تدفق الخلايا.
الطرق المستخدمة
- الأجهزة المكروية للتجارب المحكومة.
- المجهر لتصور حركة البكتيريا.
- قياس تدفق الخلايا لتحديد عدد السكان البكتيري.
- دمج التقنيات لدراسة ديناميات النقل.
النتائج الرئيسية
- تبرهن ناجحة على نقل البكتيريا باستخدام الأدوات التي تم تطويرها.
- رؤى حول سلوك البكتيريا في الوسط المساميّ.
- تطبيقات محتملة في المعالجة الحيوية والسيطرة على الأمراض.
- تأسيس إطار عمل للبحث المستقبلي في نقل الميكروبات.
الاستنتاجات
- مزج المكرويات، المجهر، وقياس تدفق الخلايا فعال في دراسة نقل البكتيريا.
- هذه الطرق يمكن أن تعزز فهم ديناميات الميكروبات في بيئات مختلفة.
- البحث الإضافي يمكن أن يعتمد على هذه النتائج لمعالجة التحديات البيئية والصحية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding microbial transport in porous media is critical for predicting environmental contamination and informing bioremediation strategies. The described tools enable simultaneous measurement across spatial scales, supporting mechanism-based model development and improving predictive confidence in microbial behavior. This multi-scale approach aids in de-risking translational applications by linking pore-scale dynamics to system-level outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbial transport hypotheses by visualizing individual cell trajectories and quantifying population-level breakthrough curves.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible methods for assessing microbial motility and deposition in controlled porous matrices.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative effluent concentration data and deposition profiles for evaluating microbial transport under varying conditions.
- Operational Value: Supports assay standardization through automated dispensing and flow cytometry readouts, enabling scalable screening of microbial strains or environmental samples.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking pore-scale bacterial movement to macroscopic transport observables, improving model extrapolation.
- Operational Value: Enables cross-scale validation, supporting risk-adjusted decisions in preclinical development of microbial-based therapeutics or bioremediation agents.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates discovery-scale imaging with population-scale quantification, positioning it between early hypothesis testing and preclinical validation stages in microbial transport studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of bacterial trajectories at the pore scale.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs such as normalized breakthrough curves and deposition profiles for comparing microbial strains or media conditions.
- Analytics: Provides statistical outputs including cell concentration calculations, trajectory analysis, and signal integration for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Connects microscopic transport mechanisms to system-level behavior, supporting continuity from discovery to preclinical evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing microbial transport across diverse porous media, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in microbial transport modeling.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability through standardized microfluidic fabrication and automated sampling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-scale data that reduce late-stage biological risk in microbial applications.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of microbial candidates or bioremediation strategies through validated transport profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, microscopy, image processing, and flow cytometry operation.
- Depends on access to plasma treatment systems, syringe pumps, automated dispensers, and fluorescence-capable microscopes.
- Necessitates cross-team standardization of image analysis thresholds and trajectory tracking protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different porous media geometries or microbial species.
- Limited by the need for transparent matrices and fluorescent labeling, which may not reflect all natural conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:57
Preparation of A Microfluidic Device in Polydimethylsiloxane (PDMS)
3:27
Preparation of a Fluidic Device in Poly(methyl methacrylate)(PMMA)
4:09
Analyze Bacterial Transport using PDMS Microfluidic Devices
5:10
Basic Image Processing
6:59
Analyze Bacterial Transport at the Pore Scale
8:08
Study Bacterial Filtration by Means of Deposition Profiles
8:51
Analyze Bacterial Transport using PMMA Fluidic Devices
10:33
Results: Motile and Nonmotile GFP-tagged P. putida KT2440
11:48
Conclusion
