Name: تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: استكشف تحليل طوبولوجيا سلاسل اليوبيكيتين باستخدام تقنية رصد التفاعل الموازي والبروتينوميات الموجهة. تتيح هذه الطريقة التعرف المحدد والتقدير الكمي للتغيرات في وفرة سلاسل اليوبيكيتين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويود المؤلفان أن يشكرا سيلين جانتي على مساعدتها في إنشاء الكريات الخلوية مع علاج MG-132 على النحو المبين في النتائج التمثيلية وإليز مومارتس على توفيرها لكريات الإشريكية القولونية المستخدمة في البروتوكول.

1. إعداد معيار الببتيد الثقيلة
<ol><li>اعتمادا على المورد وجودة الببتيدات الثقيلة التي تم شراؤها ، فإن الببتيدات الثقيلة تحتاج إلى تخفيفها. استخدم هذا البروتوكول تسلسل الببتيد المبلغ عنها في الجدول 1، مع الأحماض الأمينية C-terminal المعدلة إلى ليسين(13C615N2-lysine) أو أرجينين (13C615N4- أرجينين).<ol>
<li>خلط الببتيدات الثقيلة، وتمييع المزيج مع 50٪ أسيتونيتريل (ACN) لإنشاء مزيج الببتيد مع كل الببتيد في 10 ميكرومتر.</li>
		<li>إنشاء aliquots من مزيج الببتيد وتخزينها في -80 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. إعداد العينة
<ol><li>تحلل العينة ملاحظة: يجب مراعاة استقرار سلاسل ubiquitin أثناء إعداد العينة. الحفاظ على العينات البيولوجية والمخازن المؤقتة المبردة في 4 درجة مئوية وإضافة عينات إلى التخزين المؤقت استقرار ubiquitin في أسرع وقت ممكن.<ol>
<li>إعداد حل من 1 M NH4HCO3 (بيكربونات الأمونيوم) في الماء وضبط درجة الحموضة إلى 8 باستخدام 1 M NaOH.</li>
		<li>إعداد حل من 200 mM N-ethylmaleimide (NEM) في الماء.</li>
		<li>إعداد ubiquitin استقرار العازلة باستخدام 8 M اليوريا في 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. يجب أن تكون مستعدة يوبيكيتين استقرار العازلة طازجة في كل مرة. ملاحظة: سوف يتطلب محلول 5 مل من 8 M يوريا أقل بكثير من 5 مل من الماء نظرا لتوسيع المياه عندما تكون في محلول مشبع مع اليوريا. تنبيه: لا تعد العازل فوق 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا إلى تشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.</li>
		<li>Resuspend العينة البيولوجية التي سيتم التحقيق فيها في العازلة استقرار في كل مكان تهدف إلى 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر من البروتين وlyse الخلايا مع طريقة مناسبة للعينة. طريقة سونيكيشن تتكون من ثلاث نبضات 10 ق مع سونيفير برانسون SFX 150 تعيين في كثافة 70٪ مع فواصل 10 ق على الجليد بين كل نبضة، واستخدمت لخطوط الخلية في هذا البروتوكول.</li>
		<li>عينة الطرد المركزي في 18,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 °C في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة.</li>
		<li>نقل supernatant إلى أنبوب الطارد الدقيق ملزمة منخفضة البروتين الطازجة. يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية عند هذه النقطة إذا لزم الأمر.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد العينة والضوابط
	<ol>
<li>إذا تم تجميد العينات، اخلط (على سبيل المثال، مع ثيرموميكسر) أثناء إذابتها لإذابة اليوريا بسرعة. تنبيه: لا تستخدم درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا لتشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.</li>
		<li>عينة الطرد المركزي في 18,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 °C في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة.</li>
		<li>نقل 20 ميكروغرام من العينة إلى أنبوب طرد دقيق منخفض الربط جديد وضبط مستوى الصوت إلى 50 ميكرولتر مع حاجز تثبيت كل مكان.</li>
		<li>إنشاء عنصر تحكم سالب باستخدام وحدة تخزين طبيعية من المخزن المؤقت لتثبيت ubiquitin (50 ميكرولتر). في هذه العينة ، لا ينبغي أن تكون هناك نسخة خفيفة من كل ببتيد ، مما يسمح بمراقبة أي تلوث خفيف ينشأ عن الببتيدات الثقيلة. واستخدمت هذه السيطرة السلبية أيضا لجدولة وقت الاحتفاظ ب PRM الموضحة في القسم 3-1.</li>
		<li>كما تم إنشاء سيطرة إيجابية مع التخزين المؤقت لتثبيت ubiquitin وإضافة أنواع السلسلة المتاحة تجاريا إلى الحجم الطبيعي لحاجز تثبيت ubiquitin (50 ميكرولتر). عادة، K63، K48، و M1 متوفرة. في النتائج التمثيلية 20 نانوغرام من K48، K63، و M1 استخدمت.</li>
	</ol></li>
	<li>الحد، الألكيل، والهضم
	<ol>
<li>إعداد حل من بيكربونات الأمونيوم 50 mm (NH4HCO3) في الماء وضبط العينة إلى درجة الحموضة = 8 مع 1 M NaOH.</li>
		<li>تم طرد ثقافة الإشريكية القولونية التي تزرع في مرق LB 5000 × ز لمدة 5 دقائق لتشكيل بيليه ، والتي تم غسلها بعد ذلك 2x مع PBS قبل إعادة الإنفاق في حاجز تثبيت في كل مكان عند 5 ميكروغرام / ميكرولتر.</li>
		<li>أضف 1 ميكروغرام من lysate الإشريكية القولونية إلى كل عينة والتحكم. يستخدم هذا البروتوكول الإشريكية القولونية (DH10B)، ولكن يمكن استخدام أي lysate معقدة دون كل مكان. لاحظ أن كل مكان مشترك بين جميع eukaryotes. ملاحظة: استخدام مصفوفة lysate القولونية يقلل من فقدان الببتيدات بسبب التصاق غير محدد إلى الأواني البلاستيكية. هذا ملحوظ بشكل خاص في السيطرة السلبية أو عينات مع محتوى البروتين محدودة ولها تأثير قوي على مراقبة K6312.</li>
		<li>إعداد حل من 500 مللي متر تريس (2-carboxyethyl)فوسفين (TCEP) في MS الصف المياه (DTT يمكن استخدامها كبديل).</li>
		<li>تقليل العينات والضوابط بإضافة TCEP إلى تركيز نهائي قدره 50 mM. دوامة لفترة وجيزة قبل احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). إذا تم استخدام DTT، يجب رفع درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية. تنبيه: لا تستخدم درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا لتشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.</li>
		<li>إعداد حل من 550 mM الكلورواسيتاميد (CAA) في NH4HCO3. تخزين في الظلام.</li>
		<li>Alkylate العينات والضوابط بإضافة CAA إلى تركيز النهائي من 55 mM. دوامة لفترة وجيزة قبل احتضان لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام. ملاحظة: يستخدم CAA بدلا من iodoacetamide كعامل تخفيض لتقليل فرصة تعديل كارباميدوميثيل مزدوج (114.0429) على بقايا ليسين يجري مخطئا لتعديل -GG (114.0429)13.</li>
		<li>إضافة endopeptidase LysC إلى العينات في 1:25 (ث / ث) نسبة إلى محتوى البروتين. حضانة لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>تمييع العينات والضوابط مع 200 ميكرولتر من 50 م م NH4HCO3 درجة الحموضة = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>إضافة تريبسين إلى العينات في 1:25 ث / ث نسبة إلى محتوى البروتين. حضانة لمدة 12 ساعة في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>إضافة 10٪ محلول حمض الفورميك (FA) في مياه درجة MS بنسبة 1:10 v/v إلى كل عينة وعينة تحكم. تحقق من أن درجة الحموضة هي < 3) قبل تنظيف C18 وإضافة المزيد من حمض الفورميك إذا لزم الأمر.</li>
		<li>لكل عينة والتحكم إضافة 0.5 ميكرولتر من معيار الببتيد الثقيلة التي تم إنشاؤها في القسم 1.</li>
	</ol></li>
	<li>تنظيف الببتيد
	<ol>
<li>تقدم العديد من الشركات المصنعة نصائح تنظيف C18 أو لوحات. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للمنتج المستخدم، والببتيدات المجففة في جهاز طرد مركزي فراغ، وعلى استعداد لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد.</li>
	</ol></li>
</ol>3. تحليل LC-MS/MS
<ol><li>تنفيذ تحليل PRM الأولي على معيار الببتيد الثقيل بطريقة غير مقررة.<ol>
<li>Resuspend العينات المجففة في 10 ميكرولتر من MS تحميل العازلة 2٪ ACN/0.05٪ حمض ثلاثي فلوريستيك (TFA).</li>
		<li>تجهيز HPLC مع عكس المرحلة C18 عمود تحليلي (75 ميكرومتر × 15 سم، 2 ميكرومتر 100 Å C18 حبات) مصممة لnanoflow MS. شكل التدرجات الخطية تبادل المياه درجة MS تكملها مع 0.1٪ FA مع ACN تحتوي على 0.1٪ FA. تم استخدام عمود فخ التضحية (75 ميكرومتر × 2 سم ، 3 ميكرومتر ، 100 حبة18 Å C) للحفاظ على حياة العمود التحليلي هنا ولكن ليس مطلوبا.</li>
		<li>يزوج إخراج العمود التحليلي بمصدر نانو-ESI على مطياف كتلة عالي الدقة.</li>
		<li>استخدام طريقة بروتيوميات مستهدفة مناسبة لمطياف الكتلة. على سبيل المثال، على Q-Exactive بالإضافة إلى أسلوب التجربة اثنين، دورة بين MS الكامل وتجربة PRM. بالنسبة لتجربة التصلب المتعدد الكامل، تم استخدام حل قدره 120,000 مع هدف AGC من 1e6 و 240 مللي ثانية كحد أقصى. وبالنسبة لتجربة إدارة الحد من الفقر، استخدم نفس الهدف من نظام تحديد القيمة المضافة والحد الأقصى من تكنولوجيا المعلومات بدقة أقل قدرها 000 60 ونافذة عزل تبلغ 1.2 م/ض.</li>
		<li>حقن 200 نانوغرام من عنصر التحكم السلبي على العمود التحليلي باستخدام الطوابع التلقائية HPLC. تطبيق تدرج خطي على العينة على العمود التحليلي زيادة تركيز ACN من 2-25٪ على مدى فترة ~ 45 دقيقة. ملاحظة: تركيز ACN 25٪ أقل من المعتاد لبروتيوميات بسبب الطبيعة الهيدروفيلية المنخفضة للببتيدات النموذجية ذات الخصائص الطوبولوجية في كل مكان. وإذا كان للببتيدات الأخرى أن تحدد كميا، فقد يكون من المرغوب فيه تركيز أعلى لل ACN لتحقيق فصل جيد للهدف.</li>
		<li>تحليل نتائج تشغيل الجدولة كما هو موضح في المقطع 4.2 لإنشاء قائمة تضمين مجدولة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحليل العينات<ol>
<li>تشغيل العينات المتبقية كما هو موضح للجدولة في 3.1 بصرف النظر عن استخدام قائمة التضمين المجدولة التي تم إنشاؤها في القسم 4.2. ملاحظة: يجب تشغيل فارغة بعد عنصر التحكم الإيجابي للتأكد من أنه يتم الكشف عن أي ترحيل من التشغيل السابق في عينات لاحقة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. تحليل البرمجيات
<ol><li>إنشاء قائمة تضمين التنسيق المناسب ل MS المستخدمة. استخدم هذا البروتوكول برنامج المصدر المفتوح Skyline (الإصدار 19.1.0.193) (https://skyline.ms)، والذي يقدم دعما ومساعدة موثقين جيدا. ويمكن إنشاء قائمة إدراج لعدة مطيافات كتلة باستخدام مرفق قائمة عزل الصادرات.<ol>
<li>افتح مستند Skyline جديد.</li>
		<li>حدد تعديلات النظائر الثقيلة حسب الاقتضاء للببتيدات الثقيلة المميزة للطبولوجيا. في الإعدادات| إعدادات الببتيد تحت علامة التبويب تعديل، انقر على حقل الاسم لرؤية التعديل المحتمل. ويستند الاختيار على الحالة النظيرية للببتيدات الثقيلة التي تم شراؤها. في هذا المثال، استخدمت الببتيدات الاصطناعية التي تحمل إما ليسين الثقيلة(13C615N2-lysine) أو أرجينين الثقيلة(13C615N4-arginine) في C-terminus. التسميات المناسبة ستكون: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" و "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>حدد الإعدادات| الانتقال. ضمن علامة التبويب تصفية تشمل رسوم السلائف 2، 3، 4.</li>
		<li>إدراج الببتيدات عن طريق تحديد تحرير| إدراج| الببتيدات.</li>
		<li>قم بتعبئة الحقول ذات الصلة بما في ذلك تسلسل الببتيد المميز للطبولوجيا واسم البروتين (على سبيل المثال، "Chain-K63").</li>
		<li>توسيع كل الببتيد هو مبين الآن في لوحة الأهداف. حذف حالات الرسوم غير المرغوب فيها. حالة الشحنة المفضلة وطاقة التصادم ، والتي قد تختلف استنادا إلى مطياف الكتلة المستخدم ، لكل ببتيد مميز طوبولوجيا موضح في الجدول 1.</li>
		<li>لكل ببتيد طوبولوجيا مميزة (باستثناء M1 حيث يتم تضمين GG في التسلسل) انقر بزر الماوس الأيمن على التسلسل وحدد تعديل. إضافة GG كتعديلات هيكلية بالنقر فوق حقل الاسم وتحديد <إظهار كافة... > قبل اختيار "غليغلي (K)".</li>
		<li>تصدير ملف قائمة العزل| تصدير| قائمة العزل، حدد نوع الأداة وتعيين نوع الأسلوب إلى قياسي. سيؤدي تحديد موافق إلى فتح مطالبة لحفظ ملف .csv * يمكن استخدامه لإنشاء أسلوب PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>إنشاء قائمة إدراج مجدولة استنادا إلى تشغيل جدولة الببتيد الثقيلة وأوضح هنا باستخدام برنامج أفق المصدر المفتوح.<ol>
<li>إنشاء قائمة أهداف كما هو موضح في المقطع 4.1.</li>
		<li>استيراد الجدولة تشغيل في 3.1 عن طريق تحديد ملف| استيراد| النتائج.</li>
		<li>راجع الهويات. يمكن ملاحظة الإشارة الثقيلة لكل ببتيد من خلال النقر على الكتلة لكل إدخال الببتيد الثقيل. غالبا ما يتم تحديد التعرف الصحيح على الذروة تلقائيا ، ولكن قد يتطلب البرنامج المعالجة اليدوية عن طريق تحديد الذروة باستخدام النقر والسحب تحت المحور س.</li>
		<li>يتم أيضا تطبيق أوقات الاستبقاء المحددة للمتغيرات الثقيلة على الإصدارات الخفيفة ، وبالتالي إنشاء جدول زمني ل PRM. يمكن تعديل إطار الجدولة ضمن الإعدادات| إعدادات الببتيد باستخدام علامة التبويب التنبؤ، عن طريق تغيير الإطار الزمني.</li>
		<li>يمكن الآن تصدير قائمة إدراج مجدولة باستخدام File| تصدير| قائمة العزل وتحديد نوع الأداة المناسبة ونوع أسلوب الإعداد إلى جدولة.</li>
	</ol></li>
	<li>تحليل البيانات.<ol>
<li>استيراد العينات بنفس الطريقة لتحليل تشغيل الجدولة في القسم 4.2.</li>
		<li>بعد الاستيراد الكامل لجميع العينات ، يوصى بعلاج التحولات. هذه هي العملية التي تتم من خلالها إزالة التحولات مع التداخل أو نسب الإشارة إلى الضوضاء الضعيفة. يظهر مثال على اللوني قبل وبعد المعالجة في الشكل 4.</li>
		<li>يمكن الآن تصدير البيانات إما عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الرسوم البيانية ذات الصلة وتحديد نسخ البيانات أو عن طريق تحديد File| تصدير| النتائج.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+post-translational+modification+statistics%3A+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90(2011).</li>
<li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li>
<li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%3A+Destruction+for+the+sake+of+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li>
<li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+structures%2C+functions%2C+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li>
<li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li>
<li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li>
<li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li>
<li>Borràs, E., Sabidó, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+targeted+proteomics%3F+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li>
<li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li>
<li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
<li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+%28SRM%29+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li>
</ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

تحليل حالة كل مكان داخل البروتيوم هو ذات أهمية متزايدة لمجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. يجب أن يركز وصف حالة الانتشار في كل مكان للعينة ليس فقط على ملف البروتينات التي يتم نشرها في كل مكان ولكن أيضا على طوبولوجيا مثل هذا الانتشار. تقييم هذه الطوبولوجيا من قبل MS المستهدفة، كما هو موضح هنا، له دور في مجموعة واسعة من التحقيقات البيولوجية.
وينبغي أن يفهم أن البروتوكول المبين هنا يوفر لمحة طوبولوجية عالمية. استخدام نهج البروتيوميات من أسفل إلى أعلى يسمح بتحديد الببتيدات التي كانت في كل مكان، ب...

التنظيم الوثيق لوظيفة البروتين والاستقرار له أهمية قصوى ، لأنها محركات رئيسية للسيطرة على علم الأحياء. يتم بناء وظيفة البروتين من عنصرين: تسلسله البوليبتيد الجوهري وأي تعديلات ما بعد النقل (PTMs). وقد تم تحديد مختلف PTMs الكيميائية بما في ذلك الجليكوزيليشن، الفوسفور، أسيتيل، والمثيلة1. في عام 1975، حدد غولدشتاين وآخرون2 بروتين صغير وأطلق عليه اسم يوبيكيتين بسبب طبيعته في كل مكان. تم العثور على يوبيكيتين أن تكون مهمة في تدهور البروتين3. ومع ذلك ، منذ ذلك الحين ثبت أن وظيفة كل مكان كجزيء إشارات تمتد إلى ما هو أبعد من تنظيم استقرار البروتين. وتشارك إشارة يوبيكيتين في مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية الأخرى, مثل استقرار البروتين, autophagy, خلية التحكم في دورة, والاتجار البروتين4.
في حين أن PTMs الأخرى ثنائية بشكل عام (أي يتم تعديل البروتين أو تركه غير معدل) لموقع معين ، يمكن أن يعدل ubiquitin بروتينا سواء كمونومر أو كسلسلة بوليمرية ، مع وجود كل مكان مرفق في حد ذاته في كل مكان. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتطور سلسلة تعدد الأضلاع هذه في العديد من طبولوجيا مع انتشار كل مكان في كل مكان سابق يرتبط بأحد مواقع الربط الثمانية5،6. يتم نقل يوبيكيتين بواسطة عملية انزيمية متعددة الخطوات (الشكل 1) حيث يرتبط C-terminus من كل مكان إلى واحدة من بقايا اليسين السبعة (K06، K11، K27، K29، K33، K48، أو K63) أو N-محطة من ubiquitin السابقة (يشار إليها باسم M1 أو كل مكان خطي)5،6. هذه الطوبولوجيا السلسلة هو المفتاح لمصير البروتين قيد التعديل. على سبيل المثال ، فإن التعديل مع سلسلة K48 أو K11 المرتبطة يؤدي إلى تدهور البروتين المعدل في proteasome ، في حين أن سلسلة خطية ضرورية لتنشيط إشارات NF-kB. وبالتالي، فإن التوزيع النسبي لهذه السلاسل من طبولوجيا ذات صلة بمجموعة واسعة من المسائل البيولوجية.
استخدام قياس الطيف الكتلي (MS) هو ذات فائدة خاصة لتحليل طوبولوجيا سلسلة ubiquitin كما أنها لا تعتمد على التفاعلات القائمة على الأجسام المضادة أو تقارب القائم7،8، وكثير منها محدودة خصوصية ولا تفرق بين أنواع السلسلة المختلفة. وهناك احتمال مختلف للكشف هو استخدام المسوخ المعدلة وراثيا في كل مكان. هنا, يتم استبدال ليسين محددة للأرجينيين, التي لا يمكن أن تدعم التعديل عن طريق كل مكان. ثم يتم تفسير عدم وجود تشكيل سلسلة في كل مكان على بروتين الركيزة كدليل على طوبولوجيا محددة9.
ويستند تحديد MS القائم على البروتينات في كل مكان على حقيقة أن C-terminus من كل مكان يحتوي على بقايا أرجينين في الموقف 74 التي يتم التعرف عليها من قبل تريبسين أثناء إعداد بروتيوليك من العينات لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد, فصل الجليسين المزدوج C-المحطة الطرفية. هذا غليغلي (-GG) لا تزال تعلق على مجموعة الأمينية ε من بقايا اليسين من بروتين الركيزة. لتحليل طوبولوجيا في كل مكان، يحدث التعديل على واحدة من بقايا اليوزين السبعة في كل مكان. وهذا يخلق مجموعة من سبعة الببتيدات الرئيسية التي تحمل بقايا ليسين التي يتم تعديلها من قبل GG، محددة لكل من طبولوجيا(الشكل 2). على سبيل المثال، مع طوبولوجيا K06، سيتم حماية ال ليسين في الموقف 6 على تسلسل الأحماض الأمينية من الهضم المحاولة مع تعديل -GG من 114 دا إضافة إلى هذا اليوزين.
ويشار إلى تحديد الببتيدات محددة سلفا من قبل MS كما proteomics المستهدفة، أو على وجه التحديد، اقتناء الببتيدالمستهدفة 10. وقد تم تطوير طريقتين اعتمادا على أداء مطياف الكتلة المستخدمة. هذه هي رصد رد الفعل المختار (SRM) ، وتسمى أيضا رصد ردود الفعل المتعددة (MRM) ، ورصد التفاعل الموازي (PRM). SRM ينطوي على اختيار التحولات التي تتكون من السلائف م / ض والمنتج أيون م / ض. وعلى العكس من ذلك، لا يتطلب إجراء إعادة المتر سوى السلائف m/z. بعد التحديد، يتم إجراء مسح كامل لعملية مسح أيونات المنتج. هذا له ميزة أنه لا يوجد اختيار أيونات المنتج المناسب للكمية على مطياف الكتلة محددة ضروري قبل القياس11. ويمكن جدولة كل من إدارة الموارد البشرية واستراتيجية الحد من الفقر، اعتمادا على الصك. الجدولة هي ممارسة تعيين نافذة زمنية يتم خلالها تضمين أيون معين للتحليل ، حيث أن الببتيدات يتم تهييثها في أوقات احتجاز محددة من النظام الكروماتوغرافي. ويؤدي تخفيض عدد الأيونات التي يجري استجوابها في أي وقت من الأوقات إلى زيادة وتيرة استجواب تلك الأيونات المقرر إجراؤها في ذلك الوقت، مما يحسن دقة البيانات.
بشكل عام ، فإن تطبيق البروتيوميات المستهدفة لطبولوجيا كل مكان هو نفس أي تجربة بروتيوميات مستهدفة أخرى. ومع ذلك، هناك اختلافان رئيسيان مهمان: أولا، يجب النظر في استقرار سلاسل البيكيتين. هناك العديد من الإنزيمات القوية التي تتحلل بسرعة عند تحلل الخلايا. وproteases في كل مكان محددة تندرج في فئتين، وthioesterases و metalloproteases. معظم الهيدرولاسيس في كل مكان هي ثيويستراس وتحمل بقايا السيستين في مركزها النشط. عن طريق الألكيلات هذه بقايا السيستين، يمكن تعطيلها. على هذا النحو ، فإن استخدام مخازن تثبيت في كل مكان تحتوي على عوامل الألكيلات ، مثل N-ethylmaleimide (NEM) ، والمواد الكيميائية عالية الإزالة ، والحفاظ على العينات المبردة أمر حيوي لتحليل ناجح. ثانيا، على عكس التجارب المستهدفة الأخرى، يتم إصلاح خيار الببتيد. في تجربة نموذجية مستهدفة ، يمكن اختيار الببتيد البروتيوتيبيك لأداء كروماتوغرافي وتأين جيد. بالنسبة لبعض الببتيدات المميزة للطبولوجيا مثل K48 ، فإن هذه الخصائص جيدة ، بينما بالنسبة للآخرين ، فهي أقل جاذبية. على سبيل المثال ، K33 الكروماتوغرافيا في الإعداد نموذجية عكس المرحلة سيئة بسبب تشكيل ملف elution امتدت ، وضعف خصائص التأين من الببتيد K27 تقليل وضوحه من قبل MS12.
في هذا البروتوكول، ونحن نصف كيفية إجراء تقييم طوبولوجيا في كل مكان من عينة بيولوجية من قبل PRM. يتم تقديم بيانات مثال على الإجراء باستخدام اضطراب البروتيازوم باستخدام علاج مثبط MG-132 في عدة أنواع مختلفة من الخلايا.

<table><tbody><tr><td>أسيتونيتريل (ACN)</td><td>ميرك</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>بيكربونات الأمونيوم (ABC)</td><td>فلوكا</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي</td><td>بيكمان كولتر</td><td>ميكروفيوج 16</td><td></td></tr><tr><td>كلوروأسيتاميد (CAA)</td><td>سيجما</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>إيبندورف لوبيند</td><td>إيبندورف</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>حمض الفورميك (FA)</td><td>ثيرمو فيشر ساینتيفيك</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>الببتيدات الثقيلة</td><td>JPT تقنيات</td><td></td><td></td>الببتيد</tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC العمود</td><td>الحراري فيشر العلمي</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C Wako</td><td></td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>مطياف الكتلة</td><td>الحراري فيشر Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide (NEM)</td><td>سلسلة التحكم الإيجابية 156100050</td><td></td><td></td>ACROS Organics</tr><tr><td>K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>سلسلة التحكم الإيجابية K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>سلسلة التحكم الإيجابية M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>برانسون سونيفير</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA)</td> <td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP)</td> <td>ثيرمو فيشر Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Waters & Elution C18 لوحات</td><td>المياه</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

تقييم الصورة العالمية للنوبولوجيا سلسلة في كل مكان داخل البروتيوم هو من المهم الإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. البروتوكول المبين هنا يستفيد من تعديل دي غليسين (-GG) المتبقي بعد الهضم المحاولة من يوبيكيتين أدرجت في سلسلة. من خلال تحديد كميا هذه الببتيدات ذات الخصائص الطوبولوجية يمكن تحديد الوفرة النسبية لكل طوبولوجيا سلسلة في كل مكان. وتفيد التقارير بأن الخطوات اللازمة لقياس هذه الببتيدات من خلال تجربة موازية لرصد التفاعل تأخذ في الاعتبار استقرار سلاسل كل مكان. يتم وصف إعداد الضوابط الثقيلة ، وتحلل الخلية ، والهضم جنبا إلى جنب مع إعداد مطياف الكتلة المناسبة وسير عمل تحليل البيانات. يتم تقديم مثال على مجموعة البيانات مع الاضطرابات في طوبولوجيا كل مكان ، مصحوبة بأمثلة عن كيفية تحسين البروتوكول يمكن أن تؤثر على النتائج. باتباع الخطوات المبينة ، سيتمكن المستخدم من إجراء تقييم عالمي لمناظر طوبولوجيا كل مكان في سياقه البيولوجي.

لإثبات استخدام تحليل سلسلة في كل مكان من قبل PRM ، تم اختيار ثلاثة خطوط الخلية: خط الخلية الميلانوما الماوس B16 ، وخطي الخلايا البشرية المشتركة A549 (الخلايا الظهارية السنية الغدية) وهيلا (خلايا سرطان عنق الرحم). نمت هذه الثقافات إلى مرحلة متوسطة في الوسائط المناسبة قبل أن يتم علاجها مع 0 أو 10 أو 100 mM MG-132 لمدة 4 ساعات قبل الحصاد. MG-132 هو مثبط بروتيسوم يمنع تدهور البروتينات المترافقة في كل مكان من قبل proteasome14. وبالنظر إلى ذلك ، فهو شرط اختبار مناسب لإثبات تحليل سلسلة ubiquitin. ويمكن ر...

تصف هذه الطريقة تقييم التغيرات العالمية في طوبولوجيا سلسلة ubiquitin. ويتم التقييم بتطبيق نهج البروتيوميات المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي.

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

نظرا لأن طبولوجيا سلسلة اليوبيكويتين المختلفة لها مجموعة واسعة من التأثيرات البيولوجية ، فإن فهم التغييرات في وفرة لها صلة بمجموعة متنوعة من الحالات البيولوجية. يسمح تطبيق مراقبة التفاعل المتوازي لتحليل سلسلة اليوبيكويتين بتحديد وطبولوجيا سلسلة يوبيكويتين وتحديدها الكمي. على عكس تجارب PRM النموذجية ، يقتصر تحليل طوبولوجيا سلسلة اليوبيكويتين على ببتيدات معدلة محددة ، والعديد منها ليس مثاليا لتحليل التصلب المتعدد.يسلط العرض المرئي لهذه التقنية الضوء على التعديلات والنتائج المتوقعة التي لوحظت لهذه الببتيدات غير المثالية. ابدأ بإعداد محلول بيكربونات الأمونيوم ، ومحلول n-ethylmaleimide ، والمخزن المؤقت لتثبيت اليوبيكويتين كما هو موضح في المخطوطة النصية. أعد تعليق العينة البيولوجية في المخزن المؤقت لتثبيت اليوبيكويتين وقم بتحليل الخلايا بطريقة مناسبة.بعد تحلل الخلية ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 18 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وانقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مرتبط بالبروتين منخفض البروتين. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين العينات على درجة حرارة سالب 20 درجة مئوية قبل المتابعة. لإذابة العينات ، قم بخلطها بسرعة باستخدام ThermoMixer ولا تستخدم درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية.بمجرد إذابتها ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 18 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

Ubiquitination هو تعديل مفتاح posttranslational التي قامت بها مجموعة من ثلاثة الانزيمات. ترتبط طفرات في الجينات المسؤولة عن هذا التعديل مع العديد من الأمراض البشرية المختلفة. هنا ، نحن تصف بروتوكولات للكشف عن البروتين في الخلايا ubiquitination...

اكتشاف بروتين Ubiquitination

يصف هذا الفيديو طريقة لاستخراج وتنقية الببتيدات الموجودة في كل مكان تحتوي على ببتيدات ثنائي جلايسين متبقية من خليط ببتيد معقد. قد تساعد الطريقة المقدمة في تحديد مواقع الانتشار الأصلية في البروتين.

استخراج الببتيدات الموجود في Ubiquitinylated على أساس التقارب المناعي: تقنية لاستخراج الببتيدات الموسومة باليوبيكويتين بشكل انتقائي من كسور الببتيد المنقاة

البروتوكول الحالي تفاصيل طريقة لقياس نشاط الانزيمات وظيفيا deubiquitinating مثلي. تحقيقات متخصصة تعديل تساهميا الانزيم وتسمح للكشف. يحمل هذا الأسلوب القدرة على تحديد أهداف علاجية جديدة.

طريقة لقياس آخر من Deubiquitinating الانزيمات في خطوط الخلايا وعينات الأنسجة

نحن نقدم طريقة لتنقية والكشف وتحديد الببتيدات diGly التي تنشأ من البروتينات في كل مكان من عينات بيولوجية معقدة. الطريقة المعروضة قابلة للاستنساخ وقوية وتتفوق على الأساليب المنشورة فيما يتعلق بمستوى عمق تحليل كل يوم.

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد قدر ة نشاط نظام يوبيكويتين بروتياسوم (UPS) بكفاءة في مقصورات خلوية مختلفة من الدماغ القوارض. ويتمكن المستخدمون من فحص أداء شركة UPS في الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابكة في نفس الحيوان، مما يقلل من مقدار الوقت وعدد الحيوانات اللازمة لإجراء هذه التحليلات المعقدة.

قياس النشاط شبه الخلوي يوبيكويتين بروتياسوم في الدماغ القوارض

يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء اوبيكييتين (Ub) و اوبيكويتين-أمثال (Ubls) بروتينيه محدده من أجل تحديد التعديلات من هذا النوع من التعديلات بعد الانتقالية (PTMs) ، المرتبطة بحاله معينه مثل العلاج أو النمط الظاهري.

تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه

تقدم هذه الدراسة بروتوكولات مفصلة في اختبار التكميل في المختبر لتحليل النشاط الحفاز E3 ubiquitin ligaalytic. تم التعبير عن البروتينات المؤتلفة باستخدام أنظمة prokaryotic مثل ثقافة الإشريكية القولونية.

في فيترو تحليل E3 يوبيكيتين ليجاز وظيفة

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص الانتشار في كل مكان لركيزة معينة و E3 ubiquitin-ligase في خلايا الثدييات. تم استخدام خطوط الخلايا HEK293T للإفراط في التعبير عن البروتين ، وتم تنقية الركيزة متعددة التواجدات في كل مكان من تحلل الخلايا عن طريق الترسيب المناعي ، وتم حلها في SDS-PAGE. تم استخدام النشاف المناعي لتصور هذا التعديل بعد الترجمة.

تقييم الركيزة في كل مكان بواسطة E3 Ubiquitin-ligase في تحلل خلايا الثدييات

يشرح هذا البروتوكول كيفية قياس تأثير التباين الجيني المرتبط باضطرابات النمو العصبي على نشاط إنزيم deubiquitylating من خلال الجمع بين تنقية البروتين المؤتلف وفحوصات انقسام سلسلة ubiquitin.

قياس النشاط الأنزيمي لإنزيمات deubiquitylating المرتبطة باضطراب النمو العصبي عن طريق مقايسة انقسام سلسلة Ubiquitin في المختبر

تظهر التجربة المستخدمة هنا طريقة لرسو الجزيئات جنبا إلى جنب مع تقنيات المسبار للتنبؤ والتحقق من التفاعل بين الجزيئات الصغيرة للطب الصيني التقليدي وأهداف البروتين.

فحص مركبات الطب الصيني التقليدي لتثبيط نشاط UCHL3 بناء على تقنية الالتحام الجزيئي ومسبار إنزيم deubiquitinating

يعد اليوبيكوتينيشن منظما حيويا لوظائف البروتين داخل الخلية. هنا، نصف طريقتين لتحليل الخلايا لاكتشاف مستويات اليوبيكوتينات في بروتين الركيزة في الخلايا الثديية ونقارن فعاليتهما في تحليل مستويات اليوبيكوتين. تم تحفيز فرط التعبير عن البروتين في خلايا HEK293T بواسطة النقل العابر، وتم اكتشاف البروتينات الشاملة في كل مكان بواسطة تحليل النقطة الغربية.

استراتيجيات مقارنة لاكتشاف اليوبيكوتينيشن في محللات الخلايا الثديية باستخدام SMAD2/SMURF2 كنموذج

استكشف تحليل طوبولوجيا سلاسل اليوبيكيتين باستخدام تقنية رصد التفاعل الموازي والبروتينوميات الموجهة. تتيح هذه الطريقة التعرف المحدد والتقدير الكمي للتغيرات في وفرة سلاسل اليوبيكيتين.

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

استكشف المزيد من الفيديوهات