Name: KRAS4b المؤتلف المجهزة بالبالكامل: عزل وتوصيف البروتين فارنيسلاتيد وميثيل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: اكتشف بروتوكولاً لعزل KRAS المفارنسل والميثيل بعائد عالٍ من خلايا الحشرات. يُمكّن هذا الأسلوب من إجراء قياسات بيوفيزيائية دقيقة لدراسة تفاعلات البروتين في بيئة شبيهة بالغشاء الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن نعترف بدعم الاستنساخ والتعبير من كاريسا غروس ، جين ميلهالكو ، ومات درو في مختبر تعبير البروتين ، مختبر فريدريك الوطني لأبحاث السرطان. وقد تم تمويل هذا المشروع كليا أو جزئيا مع الأموال الاتحادية من المعهد الوطني للسرطان ، والمعاهد الوطنية للصحة ، ببموجب العقد رقم HHSN261200800001E. لا يعكس محتوي هذا المنشور بالضرورة اراء أو سياسات أداره الصحة والخدمات الانسانيه ، كما انه لا يشير إلى الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات التي تنطوي علي تاييد حكومة الولايات الامريكيه

<ol><li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+prenylation%3A+more+than+just+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li>
<li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Prenylation%3A+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li>
<li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity%3A+implications+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li>
<li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).</li>
<li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pleiotropic+effect+of+statins%3A+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li>
<li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758(2013).</li>
<li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li>
<li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li>
<li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li>
<li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dragging+ras+back+in+the+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li>
<li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).</li>
<li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-Ras4B+lipoprotein+synthesis%3A+biochemical+characterization%2C+functional+properties%2C+and+dimer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li>
<li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+%284B%29+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li>
<li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li>
<li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li>
<li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79(2019).</li>
<li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li>
<li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect%2Fbaculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li>
<li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE%CE%B4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanism+of+drug%2FLipid+membrane+interactions+using+Biacore%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li>
<li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li>
<li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li>
</ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

وكما لوحظ في قسم النتائج التمثيلية ، فان الخطوة الأكثر اهميه اثناء التنقية هي التعامل مع العينة خلال الوقت الذي يكون فيه الملح السفلي. الحد من الوقت الذي يتعرض العينة إلى اقل من 200 mM NaCl سوف تساعد في الحد من هطول الامطار وزيادة الغلة عينه. ويمكن ان يكون تفسير نتائج اللجنة الخاصة صعبا إذا كان الملف الشخصي لا يطابق التوقعات (انظر الشكل 2). وحتى يصبح البروتوكول روتينيا ، فانه ينصح بان يتم تخزين كسور الشطف CEX التي لا يتم نقلها إلى الامام في-80 درجه مئوية حتى يتم الانتهاء من التحليل الشامل ال...

التعديلات بعد الانتقالية تلعب دورا رئيسيا في تحديد النشاط الوظيفي للبروتينات. التعديلات مثل فوسفولات و glycosylation راسخة جيدا. ومع ذلك ، فان التعديلات الدهنية اقل تميزا. ويقدر ان ما يصل إلى 0.5 ٪ من جميع البروتينات الخلوية قد يكون قبل الزواج1. [برتيلايشن] النقل من [15-كربون] [فرنيسيل] أو [20-كربون] جيرانيلجيرانيل دهن سلسله إلى [اكتور] بروتين يحتوي ال [كاكس] عزر2. وقد تورط البروتينات قبل الزواج في تطور العديد من الامراض البشرية بما في ذلك الشيخوخة المبكرة3, الزهايمر4, العجز القلبي5, تنكس المشيميه6, والسرطان7. الصغيرة GTPases ، HRAS ، NRAS ، و KRAS1، الصفيحات النووية ، والاعمال الروتينية cenp-E و F هي البروتينات farnesylated تحت الشرط القاعدي. GTPases الصغيرة الأخرى ، وهي الروا ، RhoC ، Rac1 ، cdc-42 ، و RRAS geranylgeranylated8، في حين يمكن ان يكون الموقد farnesylated أو geranylgeranylated9.
الصغيرة GTPase KRAS4b يعمل كمفتاح الجزيئية ، ونقل أساسا عامل النمو خارج الخلية يشير إلى مسارات محول الاشاره داخل الخلايا التي تحفز نمو الخلايا والانتشار ، عن طريق التفاعلات بروتين البروتين متعددة. هناك نوعان من الجوانب الرئيسية لKRAS4b الكيمياء الحيوية التي هي ضرورية لنشاطها. أولا ، دورات البروتين بين الناتج المحلي الإجمالي غير النشط والدولة النشطة GTP ملزمه حيث يتفاعل بنشاط مع المستجيبين. الثانية ، وهو C-المحطة الطرفية بولي يسين المنطقة وسيستين فارنيسلاتيد وكربوكسيميثياتيد مباشره البروتين إلى غشاء البلازما ، وتمكين التوظيف وتفعيل المستجيبين المصب. متحولة KRAS4b هو سائق اونكوغينيك في البنكرياس, القولون والمستقيم, وسرطان الرئة10, وعلي هذا النحو, التدخل العلاجي سيكون لها فائده سريريه ضخمه. إنتاج البروتين المؤتلف المعدل بشكل أصلي والذي هو farnesylated و كربوكسيميثليتيد من شانه تمكين الفحص البيوكيميائية باستخدام KRAS4b في تركيبه مع البدائل غشاء مثل الدهنية أو الدهون نانوديسك11،12.
فرينسريل ترانسفيتاز (FNT) يحفز أضافه بيروفوسفات فارنيسيل إلى C-الطرفية السيستين في عزر CAAX في KRAS4b. بعد الزواج ، يتم الاتجار بالبروتين إلى الشبكية الاندوبلازميه (ER) حيث يلتصق انزيم راس التحويل (RCE1) بالبقايا الثلاثة للمحطة C. الخطوة الاخيره في معالجه هو ميثيل من الجديدة ج-الطرفية farnesylcysteine بقايا من البروتين الغشاء ER ، ايزوريزيلسيستين ميثيل ترانسفيرتاز (ICMT). التعبير عن KRAS4b المؤتلف في e. القولونية النتائج في إنتاج بروتين غير معدله. وكانت المحاولات السابقة لإنتاج الKRAS4b المجهزة محدوده بسبب عدم كفاية الغلة لتجارب الفحص الهيكلي أو الدوائي أو فشلت في تلخيص البروتين الناضج الأصلي الكامل الطول13,14. البروتوكول المعروض هنا يستخدم نظام التعبير خليه الحشرات المستندة إلى الفيروسات التي تعتمد علي البكتيريا وطريقه تنقيه التي تولد تنقيه عاليه ، ومعالجتها بالبالكامل KRAS4b في غله من 5 ملغ/لتر من ثقافة الخلية.
وصف البروتين الدقيق ضروري للتحقق من جوده البروتينات المؤتلف قبل الشروع في البيولوجيا الانشائيه أو دراسات فحص المخدرات. اثنين من المعلمات الرئيسية للمعالجة بالبالكامل KRAS4b هي التحقق من التعديل الصحيح قبل الزواج وتوافر فارنيسلاتيد و الكربوكسيميثيلتيد C-المحطة (FMe) للتفاعل مع بدائل الغشاء أو الدهون. وقد استخدم مقياس الطيف الكتلي للتاين بالكهرباء (ESI-MS) لKRAS4b لقياس الوزن الجزيئي والتاكد من وجود التعديلات التي أدخلت علي فارنيسيل وكربوكسيل الميثيل. واستخدم قياس الطيف الكتلي الأصلي ، حيث يتم رش العينات بالمذيبات غير المستخدمة ، لإثبات ان KRAS4b كانت ملزمه أيضا بالعامل المساعد للناتج المحلي الإجمالي. وأخيرا ، تم استخدام الطيفية صدي البلازما السطحية لقياس الربط المباشر لل KRAS4b مع الدهنيات المعبئة.

<table><tbody><tr><td>1.8 مل أنابيب القفل الآمن ،</td><td>إبيندورف</td><td>طبيعي 22363204</td><td></td></tr><tr><td>11 مم Cl SS قوارير أخذ العينات الأوتوماتيكية المتشابكة</td><td>Thermo Scientific</td><td>30211SS-1232</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>850457 شراء <td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td></td><td>كمخزون سائل في الكلوروفورم</td></tr><tr><td>1-بالميتويل -2-أوليويل-جلسيرو -3-فوسفو-إل-سيرين (POPS)</td> <td>أفانتي 840034 شراء POLAR LIPIDS</td><td></td><td>كمخزون سائل في الكلوروفورم</td></tr><tr><td>5427R جهاز طرد مركزي</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile ، HPLC Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>A998-1 1L</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250g</td><td></td></tr><tr><td>غاز الأرجون</td><td>Airgas</td><td>ARUP</td><td></td></tr><tr><td>لوحة الفحص 384</td><td>CORNING</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue Snap-It Seals ، T / S</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-54B</td><td></td></tr><tr><td>برانسون بالموجات فوق الصوتية حمام</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-336-1000</td><td></td></tr><tr><td>عمود تبادل الكاتيون الكروماتوغرافيا (CEX)</td><td>GE Healthcare Life</td><td>Sciences 29018183</td><td>HiPrep SP Sepharose عالية الأداء</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Dyna Pro Plate Reader</td><td>Wyatt Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exactive Plus EMR مطياف الكتلة</td><td>الحراري العلمي</td><td></td><td></td></tr><tr><td>حمض الفورميك</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500Ml</td><td>استخدم كاشف الصف أو أفضل</td></tr><tr><td>قوارير جيلسون 7x14 مم أنابيب</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-12</td><td></td></tr><tr><td>قوارير الخيط اللولبي الزجاجي مع بطانات رغوة</td> <td>PTFEالتخصصات العلمية</td><td>B69302</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي عالي السرعة / منضدة</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-112-114D</td><td>قادر على ما يصل إلى 4,000 xg</td></tr><tr><td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) بروتياز</td><td>Addgene</td><td>92414</td><td>منقى وفقا ل Raran-Kurussi et al. (2017) إزالة علامات التقارب باستخدام TEV Protease. في: Burgess-Brown N. (محرران) التعبير الجيني غير المتجانس في بكتريا قولونية. طرق في البيولوجيا الجزيئية ، المجلد 1586. مطبعة هيومانا ، نيويورك ، نيويورك</td></tr> عمود <tr><td>كروماتوغرافيا تقارب المعادن الثابت (IMAC)</td><td>GE Healthcare Life</td><td>Sciences 28-9365-51</td><td>HisPrep FF 16/10</td></tr><tr><td>إمدادات المياه الداخلية ، مقاومة Arium Advance</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>من 18 M & Omega ؛ </td></tr><tr><td>طقم بثق دهني 0 سم مع حامل</td><td>أفانتي بولبيان ليبيدات</td><td></td><td></td></tr> 610023 <tr><td>نيتروجين سائل</td><td>Airgas</td><td>NI-DEWAR</td><td></td></tr><tr><td>M110-EH Microfluidics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MabPac RP UHPLC عمود ، 4 أمهات ، 3.0 × 50 مم</td><td>عمود 088645</td><td></td><td></td>Thermo Scientific</tr><tr><td>MabPac SEC-1 ، 5 أمهات ، 300 & Aring ؛ 2.1 × 150 مم</td><td>Thermo Scientific</td><td>088790</td><td></td></tr><tr><td>برنامج MagTran</td><td>الميثانول العلمي</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الحراري ، HPLC Grade</td><td>VWR Chemicals</td><td>BDH20864.400</td><td></td></tr><tr><td>نظام كروماتوغرافيا</td><td>NGC BioRad</td><td>78880002</td><td>NGC QuestTM 100 نظام كروماتوغرافيا</td></tr><tr><td>كوكتيل مثبط إنزيم البروتينات بدون EDTA أو مخلبات أخرى</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>أغطية مطاطية من النوع 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-02</td><td></td></tr><tr><td>Series S Sensor Chip L1</td><td>GE Healthcare</td><td>29104993</td><td></td></tr><tr><td>مقياس الطيف</td><td>الضوئي الحراري Fischer Scientific</td><td>13-400-519</td><td>امتصاص عند 280 نانومتر</td></tr><tr><td>Ultra-15 وحدات تصفية الطرد المركزي ، 10K NMWL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>PES غشاء</td></tr><tr><td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 مل مرشحات الطرد المركزي</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي فائق</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima - L80K</td><td>قادر على 100,000 xg</td></tr><tr><td>Vanquish UHPLC (مضخة ، قلب عمود ، ونظام LC)</td> <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Water ، HPLC Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-1L</td><td>قد يستخدم مصدر مياه داخلي (انظر أدناه)</td></tr> <tr><td>حقنة Whatman GD / XP PES 0.45 مم تصفية</td><td>GE Healthcare - Whatman</td><td>6994-2504</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur QualBrowser</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>proteomics</td></tr></tbody></table> software

kras4b المؤتلف المجهزة بالبالكامل: عزل وتوصيف البروتين فارنيسلاتيد وميثيل

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

البروتين قبل الزواج هو تعديل المفتاح الذي هو المسؤول عن استهداف البروتينات لاغشيه داخل الخلايا. KRAS4b, الذي تحور في 22% من السرطانات البشرية, يتم معالجتها من قبل farnesylation و كربوكسيميثييون بسبب وجود ' CAAX ' عزر مربع في C-المحطة. تم استخدام نظام الفيروسات التي تمت هندستها للتعبير عن KRAS4b في خلايا الحشرات وتم وصفه سابقا. هنا ، ونحن وصف مفصله وعمليه تنقيه وتوصيف البيوكيميائية للبروتين. وعلي وجه التحديد ، استخدمت التقارب واللوني تبادل الأيونات لتنقيه البروتين إلى التجانس. واستخدم قياس الطيف الكتلي السليم والأصلي للتحقق من صحة التعديل الصحيح لKRAS4b وللتحقق من ربط النيوكليوتيد. وأخيرا ، تم قياس جمعيه غشاء من farnesylated و KRAS4b الكربوكسيميثيد إلى الجسيمات الشحمية باستخدام البلازما الطيفية الرنين السطحي.

واحد من أكبر المتغيرات في البروتوكول هو كميه البروتين المستهدف المعرب عنه (His6-KRAS4b). تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام عزل من خط Trichoplusia ni الخلية ، قوات التحرير الاندونيسي17، تكييفها لنمو التعليق والمشتكي من المصل. ونظرا لطائفه واسعه من النتائج المبلغ عنها عبر مختلف خطوط الخلايا الحشرية مع نظام التعبير الفيروس المناعي ، فانه من المستحسن ان تستخدم قوات التحرير الاندونيسي ، علي الأقل في البداية ، لإنتاج KRAS4b-FMe.
وينبغي ان يكون البروتين الداكن الذي يها...

[برتيلايشن] تعديل مهمة علي طرفيه غشاء يربط بروتينات. يمكن التلاعب بخلايا الحشرات لإنتاج KRAS4b بكميات من البروتينات والبروتينات والدهون البروتينية والتي تمكن من القياسات البيوفيزيائية.

KRAS4b المؤتلف المجهزة بالبالكامل: عزل وتوصيف البروتين فارنيسلاتيد وميثيل

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

بروتوكول لدينا يسمح لعزل وفصل KRAS المجهزة بشكل صحيح في العائد العالي. إنتاج رقة فرقة أصيلة وcarboxymethylated يجعل من الممكن إجراء التجارب التي لديها KRAS في غشاء تماما كما هو الحال في خلايا الثدييات. ارتفاع العائد من البروتوكول يميزه عن العمل السابق.نحن عادة تنقية ثلاثة إلى خمسة ملليغرام من البروتين لكل لتر من مواد التعبير. وهذا يسمح لنا بإجراء مجموعة متنوعة من التجارب البيولوجية الفيزيائية والهيكلية. تحور KRAS في 20٪ من السرطانات و 90٪ في سرطان البنكرياس.لذا فإن وجود بروتوكول لإنتاج بروتين مُعالج بشكل أصلي مفيد جدًا لتطوير شاشات الأدوية بحيث يمكنك دراسة البروتين الفعلي كما سيكون على غشاء الخلايا السرطانية. هذا البروتوكول هو أيضا مفيدة جدا لدراسة البروتينات الأخرى التي هي فارينيلات ومعالجتها بشكل كامل في الخلايا. وعلى هذا النحو، كل ما عليك القيام به هو مبادلة خارج KRAS مع البروتين من الفائدة ووضعها في فيروس الباكولو.الخطوات الحاسمة هي تلك حول تبادل اللونية الموجبة. استخدام العمود السليم والحد من الوقت البروتين هو في انخفاض العازلة الملح ضرورية للنجاح. فهم أن هطول الأمطار ليست نوع من العالم الثلجي الحدث يساعد على توجيه تلك الجديدة إلى البروتوكول.يتم تعزيز هذا بإظهار الحاجة إلى تقسيم تحميل عمود تبادل الموجبة إلى عدة أحمال أصغر. بعد lysing الخلايا، وتوضيح lysate، وتنقية البروتين الهدف من قبل IMAC، وتحليل كسور البروتين باستخدام صفحة SDS وتلطيخ Coomassie. تجمع الكسور الذروة وs dialyze تجمع بين عشية وضحاها ضد اثنين من لترات من العازلة D في أربع درجات مئوية.في اليوم التالي، قم بإزالة العينة من غسيل الكلى والطرد المركزي عند 4,000 مرة ز لمدة 10 دقائق لإزالة أي ترسب. العينة النهائية التي تم توضيحها و اضحة غالبا ما تكون ضبابية ولكن يمكن تطبيقها على العمود CEX دون مزيد من المعالجة. إعداد 20 ملليلتر تبادل العمود عن طريق غسله مع ثلاثة مجلدات العمود من العازلة G، ثم مع ثلاثة مجلدات العمود من F.Next العازلة، وتمييع 20 ملليلتر من عينة dialyzed إلى تركيز كلوريد الصوديوم النهائي من 100 ملليمولار عن طريق إضافة 20 ملليلتر من المخزن E وتطبيق العينة على عمود تبادل.ومن الأهمية بمكان للتخفيف من كمية صغيرة من العينة بدلا من جميع مرة واحدة، وينبغي تطبيق العينات المخففة على العمود مباشرة بعد التخفيف للحد من هطول للبروتين. استمر في تحميل العمود مع عينة مخففة حديثاً حيث يقترب التخفيف السابق من نهاية الحمل. ثم غسل العمود إلى امتصاص خط الأساس 280 مع العازلة F التي تتطلب عادة وحدات التخزين ثلاثة أعمدة.Elute البروتين من العمود مع التدرج 400 ملليلتر من العازلة F إلى 65٪ العازلة G، وجمع eluent في ستة كسور ملليلتر. بمجرد اكتمال التدرج ، استمر في غسل العمود للحصول على وحدات تخزين أعمدة إضافية 1.5 من 65٪ من العازلة G.Choose الكسور الإيجابية استنادًا إلى كل من صفحة SDS وتحليل البقع الزرقاء Coomassie وكذلك فحص أثر الأشعة فوق البنفسجية للكروماتوغرام. ثم قم بتجميع البروتين وهضمه مع Protease His6 TEV وفقًا لاتجاهات المخطوطات.بعد الهضم وغسيل الكلى، قم بتحميل البروتين على عمود IMAC 20 ملليلتر مع المخزن المؤقت A عند ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. جمع سبعة كسور ملليلتر خلال هذا الكروماتوغرافيا وغسل العمود مع ما مجموعه ثلاثة مجلدات العمود من العازلة A أو حتى يتم الوصول إلى امتصاص خط الأساس. Elute البروتين الهدف مع خمسة تدرج حجم العمود من المخزن المؤقت C من 0٪ إلى 10٪، وجمع سبعة كسور ملليلتر.ثم تحديد الكسور الموجبة مع صفحة SDS. عند تحليلها مع صفحة SDS ، يجب أن تحتوي على شريط داكن يهاجر إلى حوالي 65 كيلودالتون الذي يتوافق مع بروتين الانصهار His6-MBP-tev-KRAS4b. ويهاجر الاتحاد المشترك بين البلدان وشركة FNTAb إلى 48 كيلودالطن.خطوة CEX ضمن تنقية أمر بالغ الأهمية لأنه يقلل من مدى تحلل البروتي وإثراء البروتين المجهزة بالكامل، ولكن هو الجزء الأكثر تعقيدا من البروتوكول. نتيجة نموذجية من هذه الخطوة لها ثلاثة الذروة البارزة مع KRAS4b-FMe ولكن يمكن أن تكون ملفات تعريف elution متغير. تحليل الكتلة سليمة باستخدام ESIMS تأكيد الكتلة الجزيئية الدقيقة للبروتينات، وبالتالي نسبة النسبية من farnesylation أو carboxymethylation.في حين أن القرعة النهائية النموذجية تحتوي على بعض KRAS4b-FARN القابلة للكشف ، كانت هذه النسبة أقل من 15٪ من حيث ذروة الارتفاع من هذا التحليل. تم استخدام التحليل الشامل الأصلي لتحديد كتلة KRAS4b المرتبطة الناتج المحلي الإجمالي. تم استبدال المذيبات العينة خلات الأمونيوم لضمان ليونة التأين مما يسمح للمجمع الأصلي بالبقاء سليمة.تم قياس التفاعل بين KRAS4b-FMe والليبوسومات مع الرنين البلازمون السطحي للتحقق من الفرقينيلية وcarboxymethylation مطلوبة لـ KRAS4b-FMe للارتباط بالأغشية. كما هو متوقع، KRAS4b-FMe ملزمة liposomes بينما لم تتم معالجة KRAS4b. تقليل الوقت الذي يتعرض فيه البروتين لملح منخفض هو الجانب الأكثر أهمية من البروتوكول الذي يؤثر على العائد.البروتين هو فقط لفترة وجيزة في هذا تركيز الملح المنخفض بعد التخفيف في العازلة E.The البروتين يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التجارب الفيزيائية الحيوية التي تستخدم المحاكاة الغشاء مثل liposomes أو نانوديسك للتحقيق في الدهون التي تتفاعل مع KRAS. باستخدام هذه البيانات، يمكننا البدء في استقراء كيفية تفاعل KRAS مع غشاء البلازما للخلية. باستخدام تنقية KRAS-FMe، كان زملاؤنا قادرين على حل هيكل الكريستال الأشعة السينية من KRAS في مجمع مع مرافق محدد لشكل من هذا البروتين farnesylated والميثيل.

fully-processed-recombinant-kras4b-isolating-characterizing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

يصف هذا البروتوكول إنتاج tetramer KLRG1 ، الذي هو أداة قوية لتحليل KLRG1 يغاندس.

بروتوكول لإنتاج Tetramer KLRG1

يوضح هذا الفيديو تقنية كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني لعزل البروتين المؤتلف من بروتين خلية الحشرة.

كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني: تقنية لعزل البروتين المؤتلف المستهدف من تحلل خلايا الحشرات بناء على صافي الشحنة السطحية

مثيلة الحمض النووي قادرة على الحفاظ على مستويات مستقرة من التعبير الجيني بالإضافة إلى السماح بتغييرات ديناميكية في التعبير الجيني استجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات. نحن نفصل التقنيات التي تسمح بدراسة التغيرات الخاصة بالجينات في مثيلة الحمض النووي وتأثير هذه التغييرات على التعبير الجيني.

ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

MRP4 ينظم العديد من الفعاليات الإشارات التي تعتمد على النوكليوتيدات دوري بما في ذلك دور توضيح مؤخرا في الهجرة الخلية. وصفنا نهج مباشرة، ولكن متعدد الأوجه لكشف أهداف جزيئية المصب MRP4 مما أدى إلى التعرف على interactome MRP4 الفريد الذي يلعب دورا رئيسيا في التنظيم صقل للهجرة الخلايا الليفية.

أساليب لدراسة Mrp4 تحتوي على المجمعات ضخم في تنظيم الخلايا الليفية الهجرة

تكمن تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي في صميم العديد من العمليات الخلوية. هنا ، نصف طريقة في الجسم الحي لعزل الحمض النووي الريبي المحدد وتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة به. هذا يمكن أن يلقي ضوءا جديدا على كيفية تنظيم الحمض النووي الريبي في الخلية.

رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية

لقد وضعنا طريقة لتنقية البروتينات التفاعل coregulatory باستخدام نظام LC-MS / MS.

بروتين طريقة التحضير لتحديد إنتاجية عالية من البروتينات التفاعل مع العامل المساعد النووية عن طريق LC-MS / MS تحليل

نقدم هنا، بروتوكولا للعزلة من الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي والبروتين من نفس العينة، في محاولة للحد من التباين، وتحسين إمكانية تكرار نتائج، وتيسير التفسيرات.

الجمع بين النوكليوتيدات والاستخراج البروتين في ايليجانس كاينورهابديتيس

نقدم النهج التجريبي لدراسة الحمض النووي الريبي-التمثيلات من مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين كيناز تنشيط الحمض النووي الريبي (PKR) أثناء دورة الخلية الثديية باستخدام خلايا هيلا. ويستخدم هذا الأسلوب فورمالدهايد مجمعات التشعب الجيش الملكي النيبالي-روبية باكستانية وإيمونوبريسيبيتيشن لإثراء الكشف روبية باكستانية زمنياً. يمكن تحليل هذه الكشف كذلك من خلال التسلسل الفائق أو قرة-بكر.

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

توفر هذه البروتوكولات المنهجية المستخدمة لتقييم النشاط الأنزيمي لأفراد عائلة البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMT) في الخلايا. يتم وصف إرشادات مفصلة حول تقييم نشاط PRMT باستخدام المؤشرات الحيوية الذاتية والخارجية ، والتعرف على الميثيل أرجينين الأجسام المضادة ، ومركبات أداة المانع.

الأساليب الكمية لدراسة البروتين أرجينين ميثيلترانسفيراز 1-9 النشاط في الخلايا

يقدم البروتوكول طريقة للارتباط التساهمي للبيوتين في الجسم الحي بالبروتينات بناء على قربها من البيوتين ليجاز المنصهر ببروتين ذي أهمية. يسمح هذا التعديل بإثراء انتقائي للبروتينات باستخدام حبات الستربتافيدين حسب الحاجة في دراسات تفاعل البروتين.

في الجسم الحي البيوتينيل القرب لدراسات تفاعل البروتين في Paramecium tetraurelia

يصف هذا البروتوكول إنتاج ريبونوكلياز SLFN14 البشري المؤتلف، وتحليله الستيكيومتري بواسطة الفوتومترية الكتلية.<br...

الإنتاج السريع لريبونوكلياز SLFN14 البشري المؤتلف، والتحليل التواقيومتري، باستخدام الفوتومترية الكتلية

اكتشف بروتوكولاً لعزل KRAS المفارنسل والميثيل بعائد عالٍ من خلايا الحشرات. يُمكّن هذا الأسلوب من إجراء قياسات بيوفيزيائية دقيقة لدراسة تفاعلات البروتين في بيئة شبيهة بالغشاء الخلوي.

KRAS4b المؤتلف المجهزة بالبالكامل: عزل وتوصيف البروتين فارنيسلاتيد وميثيل

استكشف المزيد من الفيديوهات