تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

يمكن استخدام هذا البروتوكول لربط أنماط نشاط الكالسيوم مع التعبير الجيني على مستوى الخلية المفردة مما يمكّن الباحثين من التحقيق في الأسئلة الجديدة حول العلاقات بين هاتين الميزتين. على النقيض من النهج السابقة، والتي عادة ما تدرس الأنسجة بأكملها، وتقنيتنا التكبير في مستوى الخلية المفردة مما يتيح لنا لتقييم العلاقات المستقلة الخلية بين نشاط الكالسيوم والتعبير الجيني. تبدأ من قبل الأشعة فوق البنفسجية تعقيم اثنين من 35 ملليمتر أطباق بيتري البلاستيكية وطبق واحد ثقافة خلية 35 ملليمتر لمدة 30 دقيقة تقريبا.

العمل في غطاء محرك الرأس تدفق لارينار، إضافة 10 ملليلتر من محلول الكالسيوم ملليمولر اثنين إلى كل من اثنين من أنابيب مخروطية البلاستيك 50 ملليلتر، واحد طبق بيتري الأشعة فوق البنفسجية تعقيم، وطبق ثقافة الخلايا المعقم للأشعة فوق البنفسجية. إضافة ملليلتر اثنين من الكالسيوم والمغنيسيوم حل الحرة للأشعة فوق البنفسجية تعقيم طبق بيتري وملء اثنين من الأطباق البلاستيكية بيتري 100 ملليمتر وطبق واحد بيتري البلاستيك 35 ملليمتر مع 0.1X MMR تكمل مع gentamicin. ثم ملء 60 ملليمتر طبق بيتري البلاستيكية مع 70٪ الإيثانول.

مباشرة قبل تشريح، مزيج دقيق 0.01 غرام من كولاجيني B في أنبوب واحد من محلول الكالسيوم. إضافة الحل إلى جديد 60 ملليمتر من البلاستيك بتري طبق واستخدام المجهر تشريح لتحديد الأجنة من مرحلة النمو المرجوة. استخدم ماصة نقل معقمة لنقل ما لا يقل عن ستة أجنة مناسبة إلى لوحة واحدة 100 ملليمتر تحتوي على MMR بالإضافة إلى جنتاميسين.

ثم نقل الجنين واحد من لوحة عقد في لوحة 100 ملليمتر الثانية من MMR بالإضافة إلى gentamicin ووضع هذه لوحة تشريح تحت المجهر. باستخدام زوج من ملقط حادة لتحقيق الاستقرار في الجنين، قشر بعناية بعيدا غشاء vitelline المحيطة الجنين مع زوج من ملقط غرامة. عندما يتم إزالة كل الغشاء، استخدم ملقط غرامة لقرصة الجنين على طول المحور الخلفي الأمامي لفصل المناطق الظهرية والبنتينتال.

استخدام ماصة نقل معقم جديد لنقل جزء الظهر إلى لوحة 60 ملليمتر من حل collagenous لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل نقل بعناية العينة مرة أخرى إلى لوحة التشريح. لإكمال تشريح، وإزالة بعناية كل من التلوث endodermal وميسودرمال المتبقية من النسيج العصبي المفترض من ectoderm ونقل بلطف explant إلى لوحة 35 ملليمتر من محلول الكالسيوم. عندما تم جمع ثلاثة explants أكثر، واستخدام P1000 micropipette لنقل كل أربعة من explants إلى لوحة 35 ملليمتر من الكالسيوم والمغنيسيوم حل الحرة مع الحرص على تجنب أي اتصال بين explants وواجهة المياه الهواء.

ثم تدور بلطف الطبق بحيث كل من explants الكتلة في وسط لوحة واحتضان العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة للسماح للأنسجة للتفكك. خلال هذه الحضانة، نقل آخر اثنين من الأجنة إلى الطبق الثاني من MMR مع جينتاميسين، وتغطية الطبق للسماح لهذه العينات لتطوير دون عائق. في نهاية الحضانة، واستخدام الغراء السوبر لإرفاق أغطية حكم صغير إلى الجزء السفلي من طبق ثقافة الخلية 35 ملليمتر واستخدام ميكروبيبيت P100 لجمع explants تفككت.

عقد الماصات في زاوية ضحلة قريبة من سطح طبق ثقافة الخلية، ووضع طرف ماصة في زاوية الشبكة التي تواجه الداخل وطرد بحزم تعليق الخلية عبر المنطقة الشواية. من الناحية المثالية، سوف تستقر الخلايا في كتلة ضيقة وكثيفة. السماح للخلايا إلى التمسك لوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

في حين أن الخلايا تستقر ، وتحديد وتسجيل مرحلة النمو من الأجنة السيطرة الشقيقة. في نهاية الحضانة، نقل طبق العينة إلى موقع محمي بالضوء وpirate 100 ميكرولترات من الحل من حافة الطبق. امزج هذا الحل مع سبعة ميكروليتر من محلول Fluo-4 AM Fluo-4 AM حمض F127 مع الأنابيب صعودا وهبوطا قبل إعادة الحجم الكامل إلى طبق العينة.

دوامة بلطف لخلط وتغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، استبدال ملليلتر واحد من صحن الزراعة explant supernatant مع ثلاثة ملليلترات من ميليمولار اثنين جديدة من محلول الكالسيوم. ثم استبدال ثلاثة ملليلترات من االسينت مع ثلاثة ملليلترات من محلول الكالسيوم الطازجة مرتين ازيد.

بالنسبة لتصوير نشاط الكالسيوم داخل اللوحات، ضع لوحة العينة على خشبة المجهر المقلوب المحمي من التعرض للضوء المحيط واستخدم علامة لتسمية النقطة الأمامية للصفيحة بحيث يمكن العثور على نفس مجال الرؤية في جلسات التصوير اللاحقة. استخدام الأهداف 10 و 20 مرات لتحديد موقع عينة تحت المجهر واختيار مجال مناسب من الرؤية التي هي خلية كثيفة ولكن ليس كثيفة بحيث يتم تكتل الخلايا أو من الصعب التمييز بشكل فردي. ضبط التركيز المجهر بحيث يكون غطاء الشبكة التي تحكم مرئية، وتغيير مجال الرؤية الأصلي حتى عدد يمكن التعرف عليه في الإطار حسب الضرورة.

الحصول على صورة حقل مشرق من حقل الرؤية المحدد مع غطاء الشبكة التي تحكم في التركيز وصورة حقل مشرق من حقل عرض المحدد مع الخلايا في التركيز. بدون صورة واضحة من coverlip مشبك ومجال الرؤية، لن تكون قادرة على المشاركة في تسجيل الخلايا الخاصة بك مع تلك الموجودة في صور الأسماك عليك توليد في وقت لاحق. ثم اضيئ العينات مع ليزر نانومتر 488.

بالنسبة لصورة لمدة ساعتين، قم بتعديل تكوين التصوير لتسجيل 901 إطار مع وقت مسح 3.93 ثانية في فاصل زمني من ثماني ثوان قبل تشغيل التكوين للحصول على الصورة. بمجرد اكتمال التصوير ، قم بإزالة اللوحة من مرحلة المجهر واستبدل المستفحل في الثقافة بميليلتر واحد من 1X MEMFA لمدة ساعتين حضانة في درجة حرارة الغرفة مع الحرص على تسجيل مرحلة النمو للأجنة التحكم في الأشقاء في بداية الحضانة. يكشف تصور مؤامرة مركبة تحتوي على آثار لجميع الخلايا المسجلة في تجربة عن الدرجة التي يمكن أن تحجب بها القياسات السائبة أو السكانية أنماطًا أكثر دقة من السلوك الشائك.

عندما يتم عزل الملامح المسجلة للخلية الفردية ، يمكن تحديد أمثلة على النشاط غير المنتظم المميز لخلايا السلف العصبية بوضوح. ولتحديد هذا التعقيد، يمكن تطبيق أساليب مختلفة لتحليل البيانات بما في ذلك المعلمات المتنوعة لتحديد الارتفاع. إذا تم التعامل مع اللوحات تقريبًا أو تم إجراء الغسلات بقوة كبيرة أثناء التهجين الفلوري في الموقع ، يمكن إزاحة الخلايا من أسطح اللوحة مما يجعل من المستحيل أن تكون الخلايا متطابقة عبر الصور.

إذا كان هذا التعطيل يؤثر فقط على بعض الخلايا في مجال الرؤية، فقد يكون من الممكن اكتشاف بعض الخلايا الموجودة داخل الصورة وتعيينها. ومع ذلك، يتم الحصول على الحد الأقصى من البيانات من تجربة يتم فيها إجراء التهجين بعناية ويتم فقدان بعض الخلايا أو إعادة تحديد موضعها بين الصور. يمكن أن تكشف نتائج التجارب التي تجمع نشاط الكالسيوم مع التعبير عن جينات علامة السلف العصبية عن العديد من الارتباطات بين أنماط محددة من نشاط الكالسيوم والأنماط الظاهرية للمرسل العصبي.

مع هذه البيانات، يمكن للباحثين التحقيق في ميزات أكثر تعقيدا من هذه أنماط الكالسيوم الديناميكية والعلاقات مع التعبير الجيني بدلا من أن تقتصر على ارتفاع بسيط العد.