إنشاء أنظمه تحديد البروتين المستحثة كيميائيا للغاية بواسطة الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية

هذا البروتوكول مهم لأنه يوفر نهجا عاما لهندسة أنظمة اتماح البروتين كمواد بيولوجية لمجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يستخدم مكتبة بروتينية شديدة التنوع لاختيار أجهزة الاستشعار البيولوجية للليغانات المختلفة بطريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة دون الحاجة إلى معدات متخصصة. ويمكن استخدام جهاز الاستشعار الحيوي المهندس للتحكم كيميائياً في سلوك الخلايا ومراقبة التغيرات في الوقت الحقيقي في مستقلبات الخلية.

من خلال هذا العرض المرئي ، يمكن للباحثين مراقبة تعليم مفصل للتقنيات مع توقع واضح للإنتاج التجريبي. تبدأ كل جولة من الاختيار عن طريق زراعة واحدة TG1 الملهية الكهربائية مستعمرة الخلية في ستة ملليلتر من 2YT المتوسطة في 37 درجة مئوية و 250 الثورات في الدقيقة الواحدة لامتصاص 600 نانومتر من حوالي 0.5. عندما تم الوصول إلى الكثافة البصرية المثلى، ضع الخلايا على الجليد.

لإعداد الخرز اختيار السلبية، وغسل 300 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي المغلفة streptavidin ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من 05٪ PBS بالإضافة إلى العازلة توين ومرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل على رف الفصل المغناطيسي. Resuspend الخرز مع ملليلتر واحد من 1 ٪ الكانين في برنامج تلفزيوني ، وتشبع الخرز مع البيوتين في خمسة أضعاف القدرة الملزمة المبلغ عنها من الخرز. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التناوب، وغسل الخرز خمس مرات مع برنامج تلفزيوني زائد توين وثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح.

بعد الغسيل الأخير، إضافة ما يقرب من واحد مرات 10 إلى جسيمات phage 13 في 1٪ الكانين و 1٪ البوم الدم البقري في PBS إلى الخرز لاحتضان ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التناوب. في نهاية الحضانة ، قم بنقل المابير إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. لاختيار إيجابي مع الخرز streptavidin ملزمة biotinylated، تشبع نصف حجم الخرز المستخدمة للاختيار السلبي في يغاند biotinylated من الاختيار في خمسة أضعاف القدرة الكاملة ملزمة حسبت وفقا للدليل.

بعد حضانة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التناوب، وغسل الخرز خمس مرات مع برنامج تلفزيوني زائد توين وثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وحده كما هو موضح، ومنع الخرز مع ملليلتر واحد من 1٪casein و 1٪ البوم الأبقار للبوم لمدة ساعة واحدة مع التناوب. في نهاية الحضانة ، وغسل الخرز المغناطيسي المغلفة streptavidin ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني زائد توين ومرات واحدة في برنامج تلفزيوني وحدها كما هو موضح ، واستخدام phage غير منضمة ل resuspend الخرز المغناطيسي المغلفة streptavidin. استخراج غير منضم phage التي تحتوي على supernatant دون إزعاج الخرز، ووضع العينة جانبا لاستخدامها كمدخلات.

ثم غسل الخرز 10 مرات مع برنامج تلفزيوني زائد توين وخمس مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح، ونقل الخرز إلى أنبوب جديد بعد كل ثلاثة يغسل لتجنب الربط غير محدد من phages ملزمة إلى الجدران أنبوب. لتنافسية elute الففاج ملزمة، إضافة 450 ميكرولترات من تركيز micromolar من الليغانة غير الحيوية إلى الخرز اختيار إيجابية، ووضع الخرز على التناوب لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، نقل اابر إلى أنبوب جديد لاستخدامها في الانتاج.

للحصول على المعايرة المدخلات، وإعداد 10 المخففات التسلسلي في برنامج تلفزيوني تصل إلى واحد مرات 10 إلى تسعة أضعاف مع phage الإدخال. نقل 10 ميكرولترات من phage المدخلات من مرة واحدة 10 إلى 7 إلى 10 إلى التخفيفات التسعة إلى 70 ميكرولتر aliquots من الخلايا TG1 المعدة. بعد 45 دقيقة في 37 درجة مئوية، لوحة الخلايا TG1 المصابة على الفردية 90 ملليمتر 2YT أطباق أجار تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين و 2٪ الجلوكوز لاحتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية.

في صباح اليوم التالي، استخدم الصيغة لحساب مدخلات phage. بالنسبة للعدوى الناتجة وال المعايرة ، أضف phages المائلة إلى ثلاثة ملليلتر من خلايا TG1 لاحتضان لمدة 45 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية. ثم إعداد 10 تخفيفات المسلسل من الخلايا المصابة في المتوسطة 2YT الطازجة تصل إلى مرة واحدة 10 إلى التركيز الثالث، ولوحة كل تخفيف على 90 ملليمتر 2YT أجار أطباق لاحتضانهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

في صباح اليوم التالي، حساب الناتج phage وفقا للصيغة. لعزل المستنسخين الفرديين من مكتبة فرعية غنية ، نقل مستعمرات واحدة من لوحات الخلايا TG1 المُثقفة بين عشية وضحاها والمصابة بالفاغة إلى 250 ميكروليتر من 2YT المتوسطة المكملة بالآمبيسيلين في البئر في لوحات عميقة آبار عقيمة لثقافتها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. عندما تصل الخلايا إلى كثافة 600 نانومتر حوالي 0.5، إضافة خمس مرات 10 إلى وحدات تشكيل البلاك تسعة لكل ملليلتر من phage مساعد CM13 إلى كل بئر، واحتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية في تناوب 250 في الدقيقة.

في نهاية الحضانة، إضافة 500 ميكرولتر من 2YT المتوسطة تكملها الأمبيسيلين و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكاناميسين إلى كل بئر، ووضع لوحة في 25 درجة مئوية و 250 التناوب في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي، تترسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي للسماح بجمع جزيئات الفسيج. للتحقق من ربط المرساة من قبل ELISA، معطف 96-جيدا لوحات ELISA مع 100 ميكرولترات من خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر streptavidin في عازلة طلاء في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

في صباح اليوم التالي، غسل لوحات ثلاث مرات في 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني زائد توين قبل إضافة 100 ميكرولترات من هدف حيوي ثنائية متناهية الصغر واحد إلى الآبار المستهدفة و 100 ميكرولترات من البيوتين ميكرومولار واحد أو homolog الهدف إلى آبار التحكم المناسبة. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وغسل لوحات خمس مرات مع برنامج تلفزيوني زائد توين في غسل، ومنع أي ربط غير محدد مع 300 ميكرولترات من 1٪ الكانين في بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل لوحات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى توين في غسل، وإضافة phage فائقة المنقى.

بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وغسل لوحات 10 مرات مع برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى توين في غسل. إضافة 100 ميكرولترات من الفجل peroxidase M13 معطف الرئيسية المضادة للبروتين إلى كل بئر لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل لوحات ثلاث مرات كما هو موضح، وإضافة 100 ميكرولترات من الركيزة TMB إلى كل بئر لاحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو حتى يتم ملاحظة تغير اللون مرئية.

ثم وقف التفاعل مع 100 ميكرولترات من حمض الهيدروكلوريك واحد المولر في البئر ، وقراءة لوحة في 450 نانومتر على مقياس الطيفي. بعد التحقق من الموثق المرساة، وينبغي أيضا إجراء فحص الموثق dimerization باستخدام نفس مكتبة البروتين التي تستهدف مجمع الموثق مرساة ligand. وتعتبر نتائج الإثراء النموذجية بعد أربع إلى ست جولات من الاختيار مؤشراً جيداً على أن هناك نسبة عالية من الزيارات المحتملة في بقية التصفيات الفرعية، وفي هذه الحالة قد لا تكون هناك حاجة إلى جولات أخرى من الاختيار.

تعد ELISA المستنسخة المفردة مناسبة لتحليل تقارب الربط النسبي والانتقائية في مرساة و binds dimerization ويسهل مقارنة الانتقائية الملزمة بين المستنسخين. وبالمثل، تحديد الموثق الديمر يسمح بتحديد المستنسخين التي تشكل heterodimer مع الموثق الارتساء غير المُشلول فقط مع أو بدون رابطة. وتشير هذه البيانات الملزمة المعتمدة على تركيز الليجندة إلى أن الأجسام النانوية المختبرة مناسبة لبناء نظام ادمح مستحث كيميائيا مقارنة بالربط الضعيف الذي أظهرته عينات التحكم.

وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الكروماتوغرافيا التحليلية التي تُستبعد من الحجم لتأكيد تكوين الهتيروديمر بين مرساة و bindsization في وجود الرباط. على سبيل المثال، في هذه التجربة، لوحظت ذروة التمثال عندما كانت مرساة وتكميم المجلدات و القنب مختلطة. في المقابل، لم يتم الكشف عن ذروة التمرم في غياب القنب أو عندما تم تحميل كل الموثق إلى العمود وحده.

وينبغي أن يكون نظام التمرم البروتيني مشفراً وراثياً في خلايا الخميرة أو الثدييات للسماح بمزيد من التحقق من أجهزة الاستشعار البيولوجية المختارة لتطويرها في تطبيقات الجسم الحي. ونحن نتوقع أن هذه الطريقة سوف تعطي الباحثين الآخرين الأدوات الفعالة والضرورية للكشف عن المستقلبات الهامة, الجزيئات إشارة, أو الأدوية في الجسم الحي مع دقة اشقاء عالية.