التصور، القياس الكمي، ورسم خرائط للخلايا المناعية في البيئة الدقيقة الورم
مارس 25, 2020
هنا، نصف استراتيجية بسيطة ويمكن الوصول إليها لتصور وقياس ورسم خرائط الخلايا المناعية في أقسام أنسجة الورم المدمجة البارافين. تجمع هذه المنهجية بين تقنيات التصوير والتحليل الرقمي الحالية بهدف توسيع قدرة تعدد الإرسال وتحليل المعلمات المتعددة لفحوصات التصوير.
التنظيم المكاني للخلايا المناعية في البيئة الدقيقة للورم له قيمة سريرية. يمكن استخدام هذه الاستراتيجية بسهولة لتصور الخلايا المناعية داخل أنسجة الورم وتحديدها وتحديدها ورسم خرائطها. وقد أحدث العلاج المناعي ثورة في علاج السرطان.
ومع ذلك، ليس كل المرضى يستجيبون بشكل جيد. قد تعمل هذه الاستراتيجية على تحديد التواقيع المناعية للأنسجة التي يمكن أن تتنبأ باستجابة جيدة لمكافحة الورم. قبل إجراء تجربة، اختبار تركيبات الأجسام المضادة وتقنيات تجريد على الأنسجة التحكم والتحقق من أن APPs دقيقة في اكتشافها من علامات الفائدة.
كما وصف مكتوب من أساليب تحليل الصور استخدام لغة التقنية المتطورة، والجمع بين النص والفيديو يسهل فهم أفضل وتكرار المنهجية. لاسترجاع مستضد من أقسام أنسجة الورم المضمنة في البرولين الثابتة ، غمر عينة الأنسجة dewaxed في جرة كوبلين من محلول استرجاع المستضد ووضع الجرة في طنجرة ضغط كهربائية تحتوي على مياه الصنبور. يجب أن لا يتجاوز مستوى المياه نصف ارتفاع الجرة حتى لا تختلط المياه مع محلول استرجاع المستضد.
أغلق الغطاء وصمام الضغط على الطباخ وعالج الشرائح بضغط عال لمدة 10 دقائق. في نهاية العلاج، افصلي الطباخ، حرري الضغط، وافتحي الغطاء. بعد أن تبرد الشرائح في طنجرة لمدة 30 دقيقة، وغسل العينات مرتين لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني الطازجة لكل غسل في جرة كوبلين جديدة، ثم استخدام قلم الماء لرسم حاجز حول كل قسم الأنسجة.
المقبل، غمر الشرائح في 0.1-الضرس الجليسين في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل شطف الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني كما هو موضح. بعد الغسيل الثاني، قم بنقل الشرائح إلى غرفة رطوبة وغطي كل قسم من الأنسجة بمحلول الحجب. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، شطف المقاطع مرتين لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني-توين الطازجة في غسل ثم إضافة الأجسام المضادة الأولية من الفائدة، المخفف في محلول حجب، إلى كل شريحة، محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، شطف الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني-توين الطازجة لمدة خمس دقائق لكل غسل، ثم تسمية المقاطع مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، شطف الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد-توين لمدة خمس دقائق لكل غسل. اتبع مع شطف واحد في الماء المقطر المزدوج.
إزالة المياه الزائدة من كل شريحة وجبل الأنسجة مع تصاعد المتوسطة تستكمل مع DAPI وشريحة الغطاء. بعد الضغط على متوسطة التركيب الزائدة ، دع الشرائح تجف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء ، قبل الحصول على صور لجميع القنوات باستخدام ماسح ضوئي كامل الشريحة. بعد المسح الضوئي، افتح الصور في برنامج تحليل الصور وانقر فوق علامة التبويب محاذاة الأنسجة.
لاستيراد الصور التي سيتم محاذاتها إلى حاوية الشرائح، حدد الصورة الأولى التي سيتم محاذاتها من قاعدة البيانات. عند تحميل كافة الصور، انقر فوق التالي في خطوات سير العمل لربط الصور وسحب كافة الصور وإفلاتها لمحاذاتها إلى الصورة الأولى. عندما يتم ربط جميع الصور حسب الاقتضاء، استخدم ما لا يقل عن ثلاثة دبابيس لكل صورة تشير إلى ميزات الأنسجة المتماثلة في الصور المرتبطة.
استخدم دبوسًا لتتبع الصورة الأولى للتحقق من جودة المحاذاة الناتجة. إذا تم الحصول على محاذاة مرضية، انقر فوق التالي لعرض طبقات الصورة وحفظ الصورة المركبة في قاعدة البيانات. لإجراء الكشف عن الأنسجة باستخدام البروتوكول المحدد من قبل المستخدم APP 1، افتح علامة التبويب تحليل الصور وافتح الصورة المركبة في وحدة تحليل الصور.
انقر فوق رمز APP فتح ثم حدد APP المناسبة. للتأكد من أن APP يعمل، انتقل إلى موقع نسيج محدد وانقر فوق معاينة. إذا كانت النتائج مرضية، انقر لمعالجة الصورة باستخدام APP المحدد.
خلال المعالجة فإن APP تحديد ما إذا كان أو لم يكن ويرتبط بكسل مع الأنسجة للسماح لتحويل جميع وحدات البكسل المرتبطة الأنسجة إلى منطقة ذات فائدة. ويمكن بعد ذلك نقل المنطقة التي تم إنشاؤها حديثا من الفائدة إلى أي من الصور الانحياز. في نهاية التحليل، انقر فوق ملف وحفظ لحفظ الصورة المعدلة مع المنطقة التي تم إنشاؤها حديثا من الفائدة.
لتجزئة الأنسجة إلى ستروما وparenchyma، افتح علامة التبويب تحليل الصورة وحدد الملفات ذات الأهمية من قاعدة البيانات. فتح APP 2، APP 2 يستخدم صورة PSR الملون لتجزئة الأنسجة. معاينة APP 2 عن طريق معالجة الصورة في حقل عرض محدد.
إذا كانت النتائج مرضية، انقر فوق تشغيل لمعالجة APP 2 على الصورة الكاملة. وسيتم تقسيم المنطقة من الاهتمام من الأنسجة إلى ستروما وparenchyma وتحديد مناطق كل منها. المناطق التي تم إنشاؤها حديثا من الفائدة ل stroma وparenchyma يمكن نقلها إلى الصور الانحياز ، ثم تصدير وحفظ الصورة المعدلة كما هو موضح.
لتحديد وقياس مجموعات الخلايا ذات الأهمية، قم باستيراد الصورة المجزأة ذات الأهمية في وحدة تحليل الصور. بعد ضبط اللون، افتح APP 3. سوف APP 3 الكشف عن مجموعات الخلايا ذات الاهتمام وقياسها ضمن parenchyma و stroma.
إذا كانت النتائج مرضية، تشغيل APP 3 على الصورة الكاملة. سيتم تسمية جميع الخلايا الفردية ذات الاهتمام ، وإحداثيات الأنسجة المخزنة ، وتحديد كثافات الخلايا ذات الاهتمام في المناطق الستروما وparenchymal. يمكن بعد ذلك حفظ الصورة المعدلة كما هو موضح.
لتنفيذ heatmapping الأنسجة من الخلايا من مصلحة الكائنات المسمى، افتح البروتوكول المناسب المعرفة من قبل المستخدم في إطار تحديد APP وانقر فوق تشغيل مطالبة APP لاستخدام إحداثيات الأجسام المسمى الأجسام المضادة لإنشاء مخطط الحرارة. مناطق الساخنة بقعة، أبرز باللون الأحمر، تحتوي على أعلى كثافة من السكان الخلية من الفائدة في حين أن المناطق الزرقاء الداكنة لديها أدنى. يمكن فرض خريطة الحرارة لصفة خلايا محددة على الصور المحاذية لتوفير معلومات إضافية حول كيفية تنظيم هذه الخلايا داخل البيئة الدقيقة للورم.
ثم تصدير وحفظ خريطة حرارة الأنسجة. من المهم التحقق من خصوصية التسميات ودقة برامج العمل المصممة والكفاءة في إزالة البقع المختلفة الموجودة في نفس القسم وإعادة استخدامها. من خلال دمج التصوير التسلسلي ، والعلامات التسلسلية ، ومحاذاة الأنسجة ، يمكن تصور المزيد من العلامات في وقت واحد ويمكن استخراج المزيد من المعلومات من عينات سريرية محدودة.
H & E تلطيخ أقسام أنسجة الورم اضمح يسمح تقييم بنية الأنسجة, مورفولوجيا الخلية, والمعلمات ذات الصلة سريريا مثل نوع الورم الخبيث, الصف الورم, والتسلل المناعي العام. يسمح تلطيخ CD34 باكتشاف الخلايا البطانية. Cytokeratin 8/18 تلطيخ يكشف عن وجود الخلايا الظهارية، ومكافحة ألفا العضلات الملساء تلطيخ العضلات يسمح بتحديد الخلايا الدهنية الليفية، تنشيط، خلايا الكبد.
إعادة التنمّ مع الأجسام المضادة ضد CD68 و Desmin تسمح بالكشف عن الضامة و myofibroblasts على التوالي. لتوصيف أفضل تسلل الورم المناعي، تلطيخ لعلامات الخلية T و myeloperoxidase يمكن أن يؤديها. يمكن أيضا أن يتم تنفيذ بيكرو سيريوس الأحمر تلطيخ لتصور الكولاجين فيبريلار وتسهيل ستروما وتجزئة parenchyma.
يمكن تحديد وحدات البكسل المرتبطة بالأنسجة داخل الأقسام الملطخة للسماح بتجزئة مقصورات مختلفة داخل منطقة معينة ذات أهمية. ويمكن بعد ذلك تحديد مجموعات الخلايا ذات الأهمية داخل كل منطقة، مما يسمح بتوليد خرائط للأنسجة يتم عرض المناطق ذات الكثافة العالية لخلايا معينة كنقاط ساخنة ومناطق ذات كثافة منخفضة نسبياً على أنها مناطق باردة. يمكن تكييف هذه المنهجية لتحديد الخلايا المناعية في عينات الأنسجة وتحديدها وتحديدها وتحديدها للتحقق من صحتها بالنسبة لأسئلة بحثية محددة وعلامة اهتمام.
يمكن تطبيق هذه الاستراتيجية على صفائف صغيرة الأنسجة لتحليل الإنتاجية العالية. ويمكن أيضا أن يقترن بالتهجين في الموقع لفحص البروتين في الموقع والتعبير الجيني في آن واحد. لقد استخدمنا هذه الاستراتيجية لتحديد وخريطة الخلايا المنتجة IL-17A في الموقع في أنسجة الكبد الليفية من المرضى.
وكما هو مبين في البروتوكول، فإن العديد من الكواشف خطرة كيميائياً وينبغي تنفيذ الإجراءات ذات الصلة في غطاء كيميائي باستخدام معدات الحماية والاحتياطات الشخصية المناسبة.
نظرة عامة
تطرح هذه المقالة استراتيجية لتصوير، وتقدير كمي، ورسم خرائط الخلايا المناعية في مقاطع أنسجة الورم. تدمج المنهجية تقنيات التصوير والتحليل الرقمي لتعزيز قدرة تعددية المقايسات التصويرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم المناعة
- بيولوجيا السرطان
- علم الأنسجة
الخلفية
- التنظيم المكاني للخلايا المناعية في الأورام له أهمية سريرية.
- تحولت العلاجات المناعية علاج السرطان، لكن الاستجابات تختلف بين المرضى.
- قد يساعد فهم التواقيع المناعية للأنسجة في التنبؤ بردود الفعل على العلاج.
- قد تكون الطرق الحالية لتحليل الصور معقدة وتقنية.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة لتصوير وتقدير فعال للخلايا المناعية في أنسجة الأورام.
- لتسهيل تحديد التواقيع المناعية للأنسجة.
- لتحسين إمكانية الوصول إلى تقنيات التصوير للباحثين.
الطرق المستخدمة
- استرجاع المستضد من مقاطع الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمغلفة بالبارافين.
- استخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية للتسمية.
- اكتساب الصور باستخدام ماسح ضوئي كامل الشريحة.
- تحليل الصور باستخدام بروتوكولات محددة من قبل المستخدم للكشف عن الأنسجة والفصل.
النتائج الرئيسية
- التصوير والرسم الناجح لمجموعات الخلايا المناعية.
- تحديد مناطق السدى والنسيج الوظيفي في الأنسجة.
- تقدير كثافة الخلايا في مناطق الأنسجة المختلفة.
- إنشاء خرائط حرارية لتصوير توزيعات مجموعات الخلايا.
الاستنتاجات
- تعزز المنهجية المطورة تحليل الخلايا المناعية في أنسجة الأورام.
- يمكن أن يساعد هذا النهج في فهم الاستجابات المناعية في السرطان.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية استراتيجيات العلاج المناعى الشخصية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding the spatial organization of immune cells in the tumor microenvironment is critical for predicting immunotherapy response and guiding target validation. This method enables quantitative mapping of immune cell populations from limited clinical specimens, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By providing unbiased, whole-tissue visualization, it enhances predictive confidence in target selection and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through spatial quantification of immune infiltrates in tumor tissue.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating immune cell localization with tissue-immune signatures predictive of anti-tumor response.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying immune phenotypes associated with treatment response or resistance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining immune contexture in stromal and parenchymal compartments.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through user-defined protocols for tissue detection, segmentation, and quantification.
- Scalability: Enables platform reuse via virtual multiparameter slides and automated analysis workflows compatible with tissue microarrays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity from discovery through preclinical validation by mapping immune cell densities across tissue regions.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by generating heat maps that visualize hot and cold spots of immune cell populations.
- Biomarker Alignment: Facilitates translational biomarker development through quantification of cell-of-interest densities in stroma and parenchyma.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to assay readiness in screening and biomarker alignment in translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling identification and mapping of immune cell populations in tissue sections.
- Screening: Enhances assay readiness through quantitative outputs such as cell densities in stromal and parenchymal regions, enabling reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers statistical outputs including cell population quantification and spatial heat mapping that help teams compare conditions across samples.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing tissue-immune signatures that inform biomarker alignment and risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability through serial imaging, sequential labeling, and tissue alignment, allowing multiple markers to be visualized from limited specimens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through spatial immune cell mapping.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability via automated image analysis using user-defined protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling data-driven prioritization based on immune contexture.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantification of immune cell densities and distribution patterns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, image analysis, and protocol optimization for multiplexed staining.
- Dependent on whole-slide scanner infrastructure and image analysis software supporting user-defined protocols (Tissuealign, Author, HISTOmap).
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, stripping efficiency, and APP validation across sites.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different tissue types or disease models beyond tumor microenvironment.
- Includes practical limitations such as the need to verify labeling specificity, APP accuracy, and stripping/reprobing efficiency before full implementation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:03
Heat-Induced Antigen Retrieval
1:46
Nonspecific Binding Blocking
2:28
Immunofluorescence Labeling
3:36
Image Alignment
4:36
Tissue Detection
5:35
Tissue Segmentation
6:28
Cell of Interest (COI) Identification and Quantification
7:15
Tissue Heatmapping
8:10
Results: Representative Visualization, Quantification, and Mapping of Cell Populations of Interest in the Tumor Microenvironment
10:02
Conclusion
