تحديد حجم الكبد في لارفال زيبرافيش باستخدام المجهر برايتفيلد

توفر هذه الطريقة طريقة لقياس حجم الكبد في سمك الحمار الوحشي اليرقات. كما أنه يسمح لتقييم آثار التلاعب الوراثي والصيدلة على نمو الكبد والتنمية. هذه التقنية توفر طريقة سريعة ودقيقة لتصور وقياس الكبد وكذلك الأمعاء والبنكرياس.

بالإضافة إلى قياس حجم الكبد، يمكن أن تكون طريقة التشريح هذه مفيدة لإعداد الكبد والأمعاء والبنكرياس للتهجين الموضعي أو التصوير confocal. قبل محاولة التدرب على اليرقات التجريبية، تأكد من أنك قضيت وقتًا طويلاً في ممارسة العينات غير التجريبية وأن يكون لديك معدل نجاح كبير. من المهم تصور التوجه السليم وحركة يرقات الحمار الوحشي والملوط من أجل إزالة الجلد دون إزعاج الأعضاء المحيطة.

في غضون ثلاثة إلى سبعة أيام بعد الإخصاب ، بعد القتل الرحيم اليرقات ، واستخدام الماصات الزجاجية ومضخة ماصة لجمع ما يصل الى 15 يرقة في أنبوب ملليلتر اثنين. غسل اليرقات مرتين مع ملليلتر واحد من PBS 1X الباردة على الجليد. إزالة أكبر قدر من برنامج تلفزيوني ممكن باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة وإضافة ملليلتر واحد من PFA أربعة في المئة الباردة في برنامج تلفزيوني.

احتضان في أربع درجات مئوية على الأقل بين عشية وضحاها مع هزاز لطيف. باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة، وإزالة PFA من الأنبوب وشطف ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة. صخرة لمدة خمس دقائق بين يشطف.

الماصات عدة يرقات في PBS في بئر واحد من تسعة بئرين طبق زجاجي مستدير القاع. تحت المجهر، وإزالة الجلد المحيط الكبد باستخدام ملقط غرامة لعقد يرقة واحدة على ظهرها، تجتاح على جانبي الرأس بلطف ممكن. ثم استخدام ملقط غرامة جدا في اليد الأخرى للاستيلاء على الجلد فقط فوق القلب.

سحب الجلد إلى أسفل قطريا نحو ذيل السمك في الجزء السفلي من الطبق على الجانب الأيسر أو الأيمن من الأسماك. كرر للجانب الآخر. مواصلة الاستيلاء على اللوحات من الجلد وسحب إلى أسفل حتى تم إزالة جميع الجلد والميلانوفورات الإفراط أو بالقرب من الكبد.

إذا كان الصفار موجودًا لمدة خمسة إلى ستة أيام في يرقات ما بعد الإخصاب ، فرفع صفار اليرقات في قطعة واحدة عن طريق حمل السمك مع ملقط ناعم على ظهره واستخدام ملقط ناعم جدًا لدفع الصفار برفق. لمدة ثلاثة إلى أربعة يرقات DPF ، أمسك السمك مع ملقط ناعم على ظهره واستخدم ملقطًا ناعمًا جدًا لسكتة صفار البدء من الجانب البطني. كشط صفار قبالة في قطع.

ضع اليرقات المُشرَّحة في برنامج PBS الطازج والبارد في أنبوب ملليلتر باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة. لتركيب اليرقات ، صب بضعة ملليلترات من ثلاثة في المئة ميثيلسيللوز على غطاء طبق بيتري نظيفة من البلاستيك. استخدام الماصات الزجاجية والميصة مضخة لإضافة اليرقات إلى ميثيل سيلولوز، مضيفا برنامج تلفزيوني أقل مع اليرقات قدر الإمكان.

تحت مجهر تشريح في التكبير منخفضة، واستخدام ملقط غرامة لتوجيه الأسماك حتى أنها تكمن على الجانب الأيمن التي تواجه اليسار. تأكد من أن الأسماك التي سيتم تصويرها تتماشى تماما مع عين واحدة مباشرة على رأس العين الأخرى. إذا كان ذيل السمكة عازمًا ، فأزل الذيل عن طريق قرصه بقوة باستخدام ملقط لإزالته بحيث تضع السمكة مسطحًا.

تكبير عالية في التكبير والتركيز على الكبد, التأكد من أن مخطط الكبد واضحة للعيان. اضغط على الزر التقاط صورة لالتقاط صورة وحفظ الملف. كرر جميع الأسماك، والتأكد من التكبير هو نفسه لكل صورة.

التقاط صورة من ميكرومتر باستخدام التكبير نفسه. لاستخدام البرنامج R لتعمي جميع صور الكبد لتجنب التحيز المحقق المحتملة وتعزيز الدقة العلمية، وإعادة تسمية الملفات عشوائيا وإنشاء ملف العشوائية التي تحتوي على قائمة بأسماء الملفات الأصلية وأسماء الملفات المكفوفين المقابلة. فتح الملفات العشوائية في النظام، بدءا من ملف واحد.

اختر أداة التحديدات الحرّة وحدد كل كبد. اضغط على التحكم-M لقياس مساحة كل كبد. لأية كبدات لا يمكن قياسها بدقة لأن لديها الجلد المتبقية، صفار، هي خارج التركيز، أو ليست سليمة، إدراج قياس العنصر النائب.

حفظ القياسات في ملف نصي. إلى unblind وتحليل البيانات، افتح ملف القياسات وملف التعشية في برنامج جدول البيانات. إدراج عمود جديد في ملف القياسات وإضافة أسماء الملفات الأصلية للملفات المكفوفين باستخدام ملف التعشية.

حفظ هذا الملف كملف قياسات غير معمَس. فرز البيانات حسب اسم الملف الأصلي. استبعاد أي قياسات الكبد التي لم تكن الصور كافية.

إذا لزم الأمر، تحويل قيم القياس إلى مقياس المطلوب في ملليمتر مربع. افتح شريط المقياس في برنامج معالجة الصور. استخدم أداة Straight Straight Line لقياس ملليمتر واحد على شريط المقياس.

ثم يقوم برنامج معالجة الصور بقياس نفس وحدات الكبد، مما يعطي عامل تحويل. استخدم عامل التحويل لتحويل القياسات في ملف القياسات غير المكفوفين. تحديد الانحراف المعياري والمتوسط ثم حساب قيم P.

في ستة أيام بعد الإخصاب ، أظهرت يرقات حمار وحشي غير معدلة وراثيا الموقف الطبيعي وشكل الكبد فوق الأمعاء. وقد زادت حمار وحشي المعدلة وراثيا بشكل كبير حجم الكبد بالمقارنة مع الأشقاء غير المعدلة وراثيا. وتظهر هنا بعض الأمثلة على الصور غير الكافية والميكروفيتر.

اليرقة مع الجلد الذي يغطي الكبد ، واليرقة مع صفار يحجب الكبد ، واليرقة مع أجزاء من الكبد مقروص قبالة ، واليرقة مع خلع الكبد والسقوط ، يرقة مع الكبد المفقود ، يرقة مع مخطط الكبد الذي يصعب تحديد ، واليرقة مع تحديد المواقع غير لائق. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم استخدام حركات صغيرة وخاضعة للسيطرة لمنع تلف الكبد. بالإضافة إلى المجهر مشرق المجال، يمكننا أيضا استخدام اليرقات تشريح بهذه الطريقة، للمجهر confocal، لتصور البروتينات مراسل الفلورسنت أو تلطيخ الفلورسنت المناعي، والتهجين في الموقع.

الفورمالديهايد أو PFA هو مادة مسرطنة مهيجة ويشتبه. يجب ارتداء القفازات عند التعامل مع PFA وينبغي معالجة الحلول المركزة في غطاء أبخرة كيميائية.