تحديد حجم الكبد في لارفال زيبرافيش باستخدام المجهر برايتفيلد
February 2nd, 2020
هنا نبين طريقة لقياس حجم الكبد في سمك الحمار الوحشي اليرقان، وتوفير وسيلة لتقييم آثار التلاعب الجيني والدوائي على نمو الكبد والتنمية.
توفر هذه الطريقة طريقة لقياس حجم الكبد في سمك الحمار الوحشي اليرقات. كما أنه يسمح لتقييم آثار التلاعب الوراثي والصيدلة على نمو الكبد والتنمية. هذه التقنية توفر طريقة سريعة ودقيقة لتصور وقياس الكبد وكذلك الأمعاء والبنكرياس.
بالإضافة إلى قياس حجم الكبد، يمكن أن تكون طريقة التشريح هذه مفيدة لإعداد الكبد والأمعاء والبنكرياس للتهجين الموضعي أو التصوير confocal. قبل محاولة التدرب على اليرقات التجريبية، تأكد من أنك قضيت وقتًا طويلاً في ممارسة العينات غير التجريبية وأن يكون لديك معدل نجاح كبير. من المهم تصور التوجه السليم وحركة يرقات الحمار الوحشي والملوط من أجل إزالة الجلد دون إزعاج الأعضاء المحيطة.
في غضون ثلاثة إلى سبعة أيام بعد الإخصاب ، بعد القتل الرحيم اليرقات ، واستخدام الماصات الزجاجية ومضخة ماصة لجمع ما يصل الى 15 يرقة في أنبوب ملليلتر اثنين. غسل اليرقات مرتين مع ملليلتر واحد من PBS 1X الباردة على الجليد. إزالة أكبر قدر من برنامج تلفزيوني ممكن باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة وإضافة ملليلتر واحد من PFA أربعة في المئة الباردة في برنامج تلفزيوني.
احتضان في أربع درجات مئوية على الأقل بين عشية وضحاها مع هزاز لطيف. باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة، وإزالة PFA من الأنبوب وشطف ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة. صخرة لمدة خمس دقائق بين يشطف.
الماصات عدة يرقات في PBS في بئر واحد من تسعة بئرين طبق زجاجي مستدير القاع. تحت المجهر، وإزالة الجلد المحيط الكبد باستخدام ملقط غرامة لعقد يرقة واحدة على ظهرها، تجتاح على جانبي الرأس بلطف ممكن. ثم استخدام ملقط غرامة جدا في اليد الأخرى للاستيلاء على الجلد فقط فوق القلب.
سحب الجلد إلى أسفل قطريا نحو ذيل السمك في الجزء السفلي من الطبق على الجانب الأيسر أو الأيمن من الأسماك. كرر للجانب الآخر. مواصلة الاستيلاء على اللوحات من الجلد وسحب إلى أسفل حتى تم إزالة جميع الجلد والميلانوفورات الإفراط أو بالقرب من الكبد.
إذا كان الصفار موجودًا لمدة خمسة إلى ستة أيام في يرقات ما بعد الإخصاب ، فرفع صفار اليرقات في قطعة واحدة عن طريق حمل السمك مع ملقط ناعم على ظهره واستخدام ملقط ناعم جدًا لدفع الصفار برفق. لمدة ثلاثة إلى أربعة يرقات DPF ، أمسك السمك مع ملقط ناعم على ظهره واستخدم ملقطًا ناعمًا جدًا لسكتة صفار البدء من الجانب البطني. كشط صفار قبالة في قطع.
ضع اليرقات المُشرَّحة في برنامج PBS الطازج والبارد في أنبوب ملليلتر باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة. لتركيب اليرقات ، صب بضعة ملليلترات من ثلاثة في المئة ميثيلسيللوز على غطاء طبق بيتري نظيفة من البلاستيك. استخدام الماصات الزجاجية والميصة مضخة لإضافة اليرقات إلى ميثيل سيلولوز، مضيفا برنامج تلفزيوني أقل مع اليرقات قدر الإمكان.
تحت مجهر تشريح في التكبير منخفضة، واستخدام ملقط غرامة لتوجيه الأسماك حتى أنها تكمن على الجانب الأيمن التي تواجه اليسار. تأكد من أن الأسماك التي سيتم تصويرها تتماشى تماما مع عين واحدة مباشرة على رأس العين الأخرى. إذا كان ذيل السمكة عازمًا ، فأزل الذيل عن طريق قرصه بقوة باستخدام ملقط لإزالته بحيث تضع السمكة مسطحًا.
تكبير عالية في التكبير والتركيز على الكبد, التأكد من أن مخطط الكبد واضحة للعيان. اضغط على الزر التقاط صورة لالتقاط صورة وحفظ الملف. كرر جميع الأسماك، والتأكد من التكبير هو نفسه لكل صورة.
التقاط صورة من ميكرومتر باستخدام التكبير نفسه. لاستخدام البرنامج R لتعمي جميع صور الكبد لتجنب التحيز المحقق المحتملة وتعزيز الدقة العلمية، وإعادة تسمية الملفات عشوائيا وإنشاء ملف العشوائية التي تحتوي على قائمة بأسماء الملفات الأصلية وأسماء الملفات المكفوفين المقابلة. فتح الملفات العشوائية في النظام، بدءا من ملف واحد.
اختر أداة التحديدات الحرّة وحدد كل كبد. اضغط على التحكم-M لقياس مساحة كل كبد. لأية كبدات لا يمكن قياسها بدقة لأن لديها الجلد المتبقية، صفار، هي خارج التركيز، أو ليست سليمة، إدراج قياس العنصر النائب.
حفظ القياسات في ملف نصي. إلى unblind وتحليل البيانات، افتح ملف القياسات وملف التعشية في برنامج جدول البيانات. إدراج عمود جديد في ملف القياسات وإضافة أسماء الملفات الأصلية للملفات المكفوفين باستخدام ملف التعشية.
حفظ هذا الملف كملف قياسات غير معمَس. فرز البيانات حسب اسم الملف الأصلي. استبعاد أي قياسات الكبد التي لم تكن الصور كافية.
إذا لزم الأمر، تحويل قيم القياس إلى مقياس المطلوب في ملليمتر مربع. افتح شريط المقياس في برنامج معالجة الصور. استخدم أداة Straight Straight Line لقياس ملليمتر واحد على شريط المقياس.
ثم يقوم برنامج معالجة الصور بقياس نفس وحدات الكبد، مما يعطي عامل تحويل. استخدم عامل التحويل لتحويل القياسات في ملف القياسات غير المكفوفين. تحديد الانحراف المعياري والمتوسط ثم حساب قيم P.
في ستة أيام بعد الإخصاب ، أظهرت يرقات حمار وحشي غير معدلة وراثيا الموقف الطبيعي وشكل الكبد فوق الأمعاء. وقد زادت حمار وحشي المعدلة وراثيا بشكل كبير حجم الكبد بالمقارنة مع الأشقاء غير المعدلة وراثيا. وتظهر هنا بعض الأمثلة على الصور غير الكافية والميكروفيتر.
اليرقة مع الجلد الذي يغطي الكبد ، واليرقة مع صفار يحجب الكبد ، واليرقة مع أجزاء من الكبد مقروص قبالة ، واليرقة مع خلع الكبد والسقوط ، يرقة مع الكبد المفقود ، يرقة مع مخطط الكبد الذي يصعب تحديد ، واليرقة مع تحديد المواقع غير لائق. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم استخدام حركات صغيرة وخاضعة للسيطرة لمنع تلف الكبد. بالإضافة إلى المجهر مشرق المجال، يمكننا أيضا استخدام اليرقات تشريح بهذه الطريقة، للمجهر confocal، لتصور البروتينات مراسل الفلورسنت أو تلطيخ الفلورسنت المناعي، والتهجين في الموقع.
الفورمالديهايد أو PFA هو مادة مسرطنة مهيجة ويشتبه. يجب ارتداء القفازات عند التعامل مع PFA وينبغي معالجة الحلول المركزة في غطاء أبخرة كيميائية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
توفر هذه الطريقة طريقة لتحديد حجم الكبد في الأسماك الزردية اليرقات، مما يسمح بتقييم التلاعبات الوراثية والدوائية على نمو وتطور الكبد. كما أنها تسهل تصور وقياس الكبد والأمعاء والبنكرياس.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا التطور
- علم الوراثة
الخلفية
- تحديد حجم الكبد أمر بالغ الأهمية لفهم تطور الأعضاء.
- تعمل الأسماك الزردية اليرقات ككائن حي نموذجي للدراسات التنموية.
- يمكن للتلاعبات الوراثية والدوائية التأثير على نمو الأعضاء.
- التقنية الصحيحة ضرورية لنجاح التشريح والتصور.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة لتحديد حجم الكبد في الأسماك الزردية اليرقات.
- لتقييم تأثير التدخلات الوراثية والدوائية على تطور الكبد.
- لتحضير الأعضاء لتقنيات التحليل الإضافية مثل التهجيني في الموقع.
الطرق المستخدمة
- تشريح الأسماك الزردية اليرقات لفضح الكبد والأمعاء والبنكرياس.
- تقنيات التصور لقياس حجم الأعضاء.
- الممارسة على عينات غير تجريبية لضمان إتقان التقنية.
- التوجيه والتحكم في الحركة أثناء التشريح لتجنب تلف الأعضاء.
النتائج الرئيسية
- تسمح هذه الطريقة بالقياس السريع والدقيق لحجم الكبد.
- تسهيل دراسة تطور الأعضاء استجابة للتلاعبات.
- توفير أساس لمزيد من الدراسات التصويرية.
- تبرهن على أهمية التقنية في النتائج التجريبية.
الاستنتاجات
- هذه الطريقة فعالة لتحديد حجم الكبد في الأسماك الزردية اليرقات.
- تدعم تقييم التأثيرات الوراثية والدوائية على نمو الأعضاء.
- التقنية الصحيحة للتشريح حاسمة للحصول على نتائج تجريبية ناجحة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantifying larval liver size in zebrafish models enables rapid assessment of drug effects on oncogene-related phenotypes, supporting early-stage target validation in hepatocellular carcinoma research. This method provides predictive confidence by linking genetic or pharmacologic interventions to measurable organ growth changes, informing portfolio triage decisions. The approach supports mechanistic de-risking by offering a quantitative, reproducible readout for pathway modulation in preclinical disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring liver area changes in response to oncogene modulation.
- Operational Value: Provides a rapid, precise quantification method suitable for high-throughput screening of genetic or pharmacologic interventions.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through objective, measurable phenotypes that correlate with disease-related hepatomegaly.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Dissection protocol prepares liver, gut, and pancreas for downstream applications like immunofluorescence and in situ hybridization.
- Reproducibility: Standardized fixation, dissection, and imaging steps ensure consistent liver area measurements across experimental groups.
- Scalability: Method allows processing of up to 15 larvae per tube, supporting batch-wise analysis for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma where hepatomegaly is an early larval phenotype.
- Translational Continuity: Enables seamless transition from discovery to preclinical validation by providing quantifiable organ size data.
- Risk-Adjusted Decisions: Liver size measurements inform go/no-go decisions based on dose-dependent or genotype-dependent growth effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a quantitative bridge between genetic manipulation and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking oncogene expression to measurable liver area changes in larval zebrafish.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (liver area in mm²) that enable reliable comparison across treatment conditions.
- Analytics: Generates measurable data (mean, standard deviation, P-values) suitable for statistical analysis and hit confirmation.
- Translational Research: Connects early phenotypic screening to preclinical continuity through disease-relevant liver hypertrophy readouts.
- Enterprise Reuse: Dissection and imaging workflow is adaptable across multiple organ systems (liver, gut, pancreas) and compatible with multiplexed downstream assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing a direct, quantifiable readout of liver growth in response to pathway modulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through blinded image analysis and scale-bar calibration.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early phenotypic assessment, reducing investment in ineffective targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by identifying compounds or genotypes that significantly alter liver size relative to controls.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, dissection, and brightfield microscopy to avoid tissue damage.
- Depends on instrumentation including dissecting microscopes, glass pipettes, forceps, and image processing software (e.g., R, ImageJ).
- Necessitates cross-team standardization of dissection technique, file blinding, and measurement protocols to minimize investigator bias.
- Adaptation considerations include adjusting dissection timing based on larval age (3–7 dpf) and yolk presence.
- Practical limitation: Liver area measurement may underestimate volume changes; complementary methods needed to distinguish hypertrophy from hyperplasia.
