Dextran وضع العلامات والشراء في خلايا الشعر الحية والوظيفية Murine Cochlear

الهدف العام لهذا البروتوكول هو دراسة امتصاص dextran فلورية العادية المسمى مع تكساس الأحمر في خلايا الشعر الحية مع قنوات mechanotransduction وظيفية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن ثلاثة كيلودالون تكساس dextran الأحمر يمكن استخدامها لتقييم وظيفة قناة mechanotransduction في خلايا الشعر الحية. لحصاد القوقعة، ضع جمجمة فأر ما بعد الولادة ستة ماوس في طبق ثقافة 60 ملليمتر يحتوي على L-15 متوسطة من Leibovitz واستخدم مقصًا جراحيًا لإجراء قطع سطحي من النهاية الأمامية إلى الطرف الخلفي للجمجمة وعبر القنوات السمعية الخارجية.

أضعاف الجلد نحو الأنف لفضح الجمجمة وجعل شق من الخلف إلى الجزء الأمامي من الجمجمة وعبر خط العين. فصل الجمجمة إلى نصفين واستخدام ملعقة صغيرة لإزالة الدماغ. عندما يمكن ملاحظة العظام الصدغية، استخدم مقص صغير لقطع حول هذه العظام لمعالجة الأنسجة.

غمر العظام الصدغية في طبق 35 ملليمتر يحتوي على متوسطة L-15 الطازجة ووضع الطبق تحت مجهر ستيريو مجهزة مع العينة حقل واسع وخارجي مصدر ضوء الهالوجين الحالي بالتناوب. استخدام ملقط لإزالة الأنسجة القوقعة المحيطة بها، القنوات شبه الدائرية والأعضاء الدهليزية. مرة واحدة وقد تم تشريح قوقعة الأذن ووضعها في طبق جديد مع وسائل الإعلام L-15 الطازجة، واستخدام ملقط الجراحية لجعل جرح ثقب واحد على النافذة المستديرة وثقب واحد في منطقة القوقعة apical.

عندما تم حصاد كل من قوقعة الأذن, وضع الأنسجة في بئر من تسعة بئر لوحة اكتئاب الزجاج تحتوي على 200 ميكرولترات من L-15 المتوسطة الطازجة. لوضع العلامات dextran من الأنسجة المعزولة، استبدال المتوسطة من كل عينة جيدا مع 200 ميكرولترات من المتوسط L-15 الطازجة تستكمل مع اثنين ملليغرام لكل ملليلتر من dextran الفلوروس مترافق من الفائدة. احتضان العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة و 25 دوران في الدقيقة في شاكر ثلاثي الأبعاد في زاوية مائلة من 25 درجة محمية من الضوء.

في نهاية الحضانة، وغسل الأنسجة مرة واحدة مع المتوسطة وأخرى مرة مع HBSS لمدة دقيقتين لكل غسل. بعد الغسيل الثاني، قم بإصلاح العينات في 4٪ من الـ paraformaldehyde لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة متبوعة بغسلين سريعين ولطيفين في HBSS. بعد الغسيل الثاني، استخدم ملقطًا دقيقًا لإزالة عظم القوقعة، والرباط الحلزوني، والغشاء القشري وغسل العضو المعزول من الكورتي في HBSS.

اتخاذ المزيد من الحذر عند إزالة غشاء tectorial شفافة منذ الأنسجة على خلايا الشعر يمكن أن تتضرر بسهولة خلال هذه الخطوة. لتسمية F-actin، permeabilizeize العينات في 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني تكملها مع 100 إلى 200 تخفيف من الفلورسنت المسمى phalloidin لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل الأنسجة مرتين إلى ثلاث مرات في HBSS الطازجة في غسل كما هو موضح تليها غسل واحد في برنامج تلفزيوني.

استخدام وسيلة مناسبة تصاعد لتركيب الجهاز من أنسجة كورتي على المجهر الزجاجي الشرائح الشعر stereocilia الجانبين وصورة العينات على المجهر الفلورسنت confocal باستخدام 63X النفط الغمر الهدف. بعد حضانة لمدة ساعتين مع ثلاثة كيلودالون ديكستران الفلوري مترافقة مع تكساس الأحمر، عضو من Corti explant من نوع البرية بعد الولادة اليوم ستة الفئران تثبت وضع علامات قوية ومحددة من كل من خلايا الشعر الداخلية والخارجية. التصوير من stereocilia خلية الشعر والهيئات الخلية يكشف أن الخلايا التي أدرجت ثلاثة كيلودالون dextran تكساس الأحمر في جسمهم الخلية أظهرت أيضا وضع العلامات الفلورية من stereocilia بهم.

الأهم من ذلك، لوحظ إشارة فلورية موحدة على طول stereocilia مع التخصيب في نصائح من صفوف ستيريو أقصر حيث تقع قناة الإرسال الميكانيكي. الهياكل الشبيهة بالهيكل في جسم الخلية من خلايا الشعر والخلايا الداعمة المجاورة كما لوحظ مما يشير إلى أن دكستران تكساس الأحمر يمكن أيضا أن تؤخذ عن طريق endocytosis. أكبر 10 كيلودالون ديكسترانس أنتجت أيضا نمط مثل حسوس في جسم الخلية من خلايا الشعر والخلايا الداعمة.

وتجدر الإشارة إلى أن وجود chelator الكالسيوم أو حاصرات قناة mechanotransduction يمنع وضع العلامات stereocilia وامتصاص ثلاثة كيلودالون دكستران تكساس الأحمر في خلايا الشعر. ومع ذلك، لا يزال النمط الشبيه بالحويّة يُلاحظ في وجود حصار قناة النقل المُيكن، مما يشير إلى أن هذا النمط من الاستيعاب مستقل عن قنوات MET الوظيفية. من المهم جدا لتشريح الجهاز من أنسجة الكورتي بعناية وتأكيد التوجه السليم لخلايا الشعر قبل تركيب الأنسجة للتصوير.

بعد وضع العلامات dextran من خلايا الشعر الحية والوظيفية، يمكن تنفيذ الكبت المناعي للأنسجة الثابتة لتحديد أنواع محددة من الخلايا من البروتينات ذات الاهتمام.