توصيف التغيرات التشكيلية أحادية الجزيء تحت تدفق القص مع المجهر الفلوري

إن قياس التغيرات التكتكية في الجزيئات الحيوية المفردة في إطار تدفق القص مفيد لفهم وظيفة الجزيئات الضمورية مثل البروتين والحمض النووي. يسمح المجهر الفلوري في الوقت الحقيقي في الموقع التصور من جزيئات واحدة في بيئات التدفق الفسيولوجية مع ارتفاع الدقة الزمانية والمكانية. هذا لا مثيل له من قبل تقنيات أخرى مثل AFM.

من خلال توصيف قوة القص التي تحت البروتينات لدينا الحمض النووي لدينا تغييرات التشكل العالمي، يمكن للمرء أن تصميم أفضل الأدوية التي تحاكي هذه الخصائص الفيزيائية الحيوية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع لدراسة السلوك أو البوليمرات الأخرى ، وخاصة البوليمرات الحيوية ، في ظروف تدفق متفاوتة والتحقيق في ريولوجيا السوائل المعقدة. توقيت الخطوات أمر بالغ الأهمية للنجاح.

نقترح ممارسة المعالجة السطحية للجهاز microfluidic والخطوات المجهرية الفلوريسين عدة مرات لتنفيذها بطريقة فعالة. التقاط التغيرات التشكلية في الجزيئات الحيوية هي ظاهرة بصرية وديناميكية أفضل مشاهدة على الفيلم. سيتفهم العلماء هذه الطريقة بشكل أفضل بعد رؤية البروتين في الوقت الحقيقي والمجهر الحمض النووي المعروض في هذا الفيديو.

لإعداد الجهاز microfluidic، إضافة خمسة أجزاء من قاعدة مِلَمَر السيليكون إلى أحد عوامل علاج جزء في قارب وزن. ويحرك المحتويات بدقة لمدة دقيقة واحدة لإنشاء حل PDMS الشفاء المسبق. ضع رقاقة السيليكون الرئيسية في طبق بيتري بلاستيكي وصب محلول PDMS على الرقاقة لإنشاء طبقة من خمسة ملليمترات.

تغطية الطبق وتركها في مجفف تحت فراغ لمدة ساعة واحدة لإزالة فقاعات الهواء. ثم احتضان طبق بيتري المغطى في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعلاج PDMS في صلبة مرنة ، مما سيؤدي إلى قنوات microfluidic يتم مصبوب في PDMS في واجهة رقاقة PDMS. في اليوم التالي، استخدم شفرة حلاقة لقطع مستطيلات 20 في 10 ملليمترات حول كل قناة microfluidic في PDMS وإزالة الكتل المستطيلة مع ملاقط.

استخدم إبرة نهاية حادة قياس 25 قياساً مع حواف حادة لكمة ثقب قطره 0.5 ملليمتر في أحد طرفي القناة، مع التأكد من أن الثقب يمر تمامًا عبر كتلة PDMS. استخدام إبرة رقيقة لكمة PDMS للخروج من الحفرة وتكرار العملية في الطرف الآخر من القناة. ضع كتلة PDMS مع جانب القناة إلى الأعلى وأغطية في غرفة آلة الربط البلازما وبدء العلاج.

عند اكتمال العلاج، ضع بسرعة كتلة PDMS على غطاء بحيث تكون القناة على اتصال بالزلة. تطبيق الضغط على حواف الكتلة، ثم ضع الجمعية PDMS coverslip على لوحة ساخنة في 115 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتعزيز السندات الدائمة. وأخيراً، أدخل 10 سنتيمتر.

0.25 ملليمتر أنبوب القطر الداخلي في فتحة منفذ في الجزء العلوي من كتلة PDMS للسماح للسوائل بسهولة التدفق من القناة. بالنسبة لعامل فون ويليبراند أو تجارب VWF تحقن ما يصل إلى 10 ميكرولترات من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر BSA-Biotin مذابة في PBS 1X معقمة في مدخل الجهاز microfluidic. حجب بعض microliters من BSA-Biotin في طرف ماصة بعد الحقن والسماح للتلميح أن تبقى جزءا لا يتجزأ من مدخل.

السماح لBSA-Biotin لاحتضان في الجهاز لمدة ساعتين مما سيؤدي إلى BSA غير ملزمة خصيصا لسطح غطاء. ثم إزالة طرف ماصة وحقن ما يصل إلى 10 ميكرولترات من محلول منع الكازين في القناة. السماح للحل الكيس لاحتضان لمدة 30 دقيقة حتى تتمكن من منع أي مواقع مجانية والحد من الربط غير محدد من الجزيئات الحيوية إلى السطح.

إزالة طرف وحقن ما يصل إلى 10 ميكرولترات من streptavidin في برنامج تلفزيوني عقيمة في القناة، والتي سوف ربط لمجموعات البيوتين من BSA-البيوتين. المقبل، حقن ما يصل إلى 10 ميكرولترات من محلول المنظفات لغسل streptavidin الزائدة. إزالة طرف وحقن إما VWF في محلول النازيلين أو لحمض نووي لامدا.

احتضان VWF لمدة ثلاث دقائق أو الحمض النووي لامدا لمدة 45 دقيقة. ثم حقن خمسة بيوتين ميليمولار الحرة لمنع مواقع الربط Streptavidin الزائدة. تحميل ملليلتر واحد من محلول حجب الـ الـ"كايسين" في حقنة و تأمينه في مضخة حقنة.

ثم نعلق على نهاية واحدة من أنابيب لإبرة حقنة وتدفق في حل لإزالة فقاعات الهواء. ما يقرب من ثلاث دقائق بعد حقن البيوتين الحرة نعلق الطرف الآخر من الأنبوب إلى مدخل الجهاز microfluidic. حدد أعلى هدف للتكبير من TIRF أو المجهر الفلوري confocal.

إذا لزم الأمر، إضافة قطرة من زيت الغمر على الهدف. ضع الجهاز microfluidic على مرحلة المجهر بحيث يكون غطاء مع الهدف. ابدأ المجهر في المجال الساطع وضبط التركيز بحيث تظهر ميزات مثل الحطام والفقاعات.

ثم ضبط المرحلة في الاتجاهات س و ص حتى حافة قناة microfluidic مرئية وتجزئات الإطار. قم بالتبديل إلى قناة FITC وضبط مستوى Z وزاوية TIRF حسب الحاجة حتى يمكن تمييز الجزيئات الخضراء الفردية. ضبط كثافة الليزر ووقت التعرض لتصور جزيئات الفلورسنت دون photobleaching لهم بسرعة كبيرة جدا.

ثم ضبط التباين لتصور أفضل للجزيئات. بالضبط بعد خمس دقائق من حقن البيوتين الحرة بدء ووقف التدفق من مضخة حقنة لمراقبة التغيرات في التشكل الجزيئي باستخدام معدلات تدفق بين 5000 و 30، 000 ميكرولتررس في الساعة. مع VWF من المهم تطبيق كمية صغيرة على الأقل من التدفق ، مثل 30 ثانية من 10 ، 000 ميكرولتر في الساعة تدفق خمس دقائق بالضبط بعد حقن البيوتين الحرة.

كرر هذا في جميع أنحاء مناطق مختلفة من الجهاز microfluidic وتحديد الجزيئات التي يمكن أن تمتد والاسترخاء على دورات متعددة من بدء ووقف التدفق. لاحظ كم من الوقت يستغرق للجزيئات للوصول إلى أقصى امتداد والاسترخاء الكامل وتسجيل أشرطة الفيديو من السلوك المستمر للجزيئات تحت تدفق القص. وغالبا ما تظهر مرونة الجزيء لتغيير تأكيد من خلال قدرته على إطالة كما يتم تطبيق معدلات القص أعلى بسبب زيادة تدفق.

التمديد مقابل منحنى معدل القص لجزيء عامل وليمبرراند فون مفيد لتميز الخصائص الميكانيكية الحيوية للبروتين. تظهر صور المجهر الفلوري للحمض النووي لامدا بالمثل زيادة التمديد عند ارتفاع معدلات القص في 30 ثانية والاسترخاء التدريجي على مدى دقيقتين بعد توقف التدفق. عند العمل مع VWF، تذكر أن تحتضنه لمدة ثلاث دقائق فقط و biotin مجانا لمدة خمس دقائق قبل بدء التدفق.

وهذا أمر بالغ الأهمية لتشكيل العدد الأمثل أو الروابط البيولوجية - streptavidin اللازمة للتفكك يمكن عكسها. يمكن تكييف هذه الطريقة لتصور التفاعلات في الوقت الحقيقي بين الجزيئات الحيوية المتعددة وتوصيف وظائفها. على سبيل المثال، يمكن للمرء أن يفهم بشكل أفضل تشكيل المكونات الصفائح الدموية عن طريق تصور كشف VWF تحت القص عالية وربطها مع جزيء الصفائح الدموية التصاق GPIb-ألفا مع هذه الطريقة.