LarvaSPA، طريقة لتركيب Drosophila Larva للتصوير على المدى الطويل الفاصل الزمني
فبراير 27, 2020
يصف هذا البروتوكول طريقة لتركيب يرقات Drosophila لتحقيق أطول من 10 ساعة من التصوير دون انقطاع الفاصل الزمني في الحيوانات الحية السليمة. يمكن استخدام هذه الطريقة لتصوير العديد من العمليات البيولوجية بالقرب من جدار الجسم اليرقات.
اليرقات هي الطريقة الأولى التي تسمح للتصوير الحي المستمر ليرقات الدوزوفيليا السليمة لأكثر من 10 ساعات مع ارتفاع دقة الزمان والمكان. يتم استخدام هذه الطريقة للكشف عن العمليات الخلوية الديناميكية للخلايا العصبية الحسية الطرفية اليرقات ودراسة العديد من العمليات الخلوية الأخرى التي تحدث بالقرب من جدار جسم اليرقة. هذه الطريقة سهلة الاستخدام وأقل محدودية على حجم اليرقة.
يمكن تركيب ست إلى تسع يرقات في غرفة التصوير في نفس الوقت ، مما يجعل التجربة ممكنة. يمكن تصنيع غرفة التصوير في وحدات الـPMS cuboids بأقل تكلفة وقابلة لإعادة الاستخدام. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة آليات التنمية dendrite والانحطاط التشعب باستخدام الخلايا العصبية التخويل اليرقات drosophila.
يمكن أن تكشف القدرة على تصوير نفس الخلايا العصبية لساعات عن مدى التغيرات العالمية الطويلة في الأنماط التشعبية التي تنشأ من السلوكيات قصيرة الأجل على مستوى الفرع الفردي. سيؤدي استخدام التكعيبات PDMS التي تتطابق مع أحجام اليرقات إلى زيادة معدل نجاح اليرقات المُشلّة. الرجاء العثور على المزيد من الأشرطة المفيدة في قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
بعد بناء كتلة الألومنيوم من متجر آلة، وختم الجزء السفلي من الإطار المعدني باستخدام زلة غطاء طويل مع الغراء الأشعة فوق البنفسجية. علاج دليل الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة لمدة 30 ثانية. إرفاق طبقات من شريط التعبئة والتغليف إلى السطح الداخلي لطبق بيتري مستطيلة أو لوحة ثقافة الخلية جولة.
استخدم طبقة واحدة لليرقات الثانية في النجوم، أو طبقتين لليرقات الثالثة المبكرة في النجوم، أو ثلاث طبقات ليرقات الثلث المتأخرة في النجوم. قطع الشريط إلى رحلات من عرض معين مع شفرة الحلاقة، 1.5 ملليمتر لشريط طبقة واحدة واثنين ملليمترات لطبقتين أو ثلاثة طبقة الشريط. اترك على الأقل مساحة خمسة ملليمترات بين الشريطين.
إزالة طبقات الشريط التي تغطي الفضاء. إزالة الغبار من السطح الداخلي للصفيح باستخدام شريط لاصق. بعد ذلك، القالب جاهز للاستخدام.
لإعداد مزيج PDMS، مزيج سبعة غرامات قاعدة PDMS في 0.7 غرام من وكيل علاج بدقة في حاوية صغيرة. ضع الحاوية في جهاز التفريغ لمدة 15 دقيقة على الأقل لإزالة الهواء من الخليط. صب ببطء حوالي 5.5 غرام خليط PDMS على القالب للوصول إلى سمك ملليمتر واحد إلى اثنين.
ضع خليط PDMS في الخليط فراغ مرة أخرى لمدة 15 دقيقة على الأقل لإزالة فقاعات الهواء المتبقية من الخليط. كسر فقاعات القليلة الماضية مع طرف ماصة. علاج PDMS على سطح مستو في حاضنة الحرارة في 65 درجة مئوية لمدة ساعتين.
بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة لتخفيف PDMS المعالجة على طول حافة القالب وفصله عن القالب. تخزين PDMS بين قطعتين من شريط لاصق كبير في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة لليرقات الثالثة المبكرة والمتأخرة في النجوم ، قطع PDMS إلى ثمانية بمقدار اثنين بمقدار ملليمتر واحد من التكعيب عن طريق وضع الأخدود الذي تم إنشاؤه بواسطة شريط الشريط في وسط الجانب الطويل من التكعيب.
بالنسبة لليرقات الثانية في النجوم ، قطع التكعيب إلى ثمانية في واحد في ملليمتر واحد. لإعداد زلة الغطاء العلوي للتركيب ، اختر ستة مكعبات PDMS مع أخاغر مطابقة لأحجام اليرقات. إزالة الغبار من سطح PDMS مع شريط لاصق.
نعلق أربع قطع من الشريط من جانبين في حجم 12 في خمسة ملليمترات على زلة غطاء طويل من 22 في 50 ملليمتر لتحديد التكعيب PDMS في وقت لاحق. ضبط المسافات بين قطعتين من الشريط على الوجهين إلى نفس عرض الأخدود PDMS. تطبيق قطرة صغيرة من الغراء الأشعة فوق البنفسجية في الأخدود من كل كوبي PDMS وإضافة ست قطرات صغيرة من الغراء الأشعة فوق البنفسجية في الفضاء بين الأشرطة من جانبين على زلة الغطاء.
لإعداد اليرقات للتركيب ، باستخدام زوج من ملقط ، قم بتنظيف اليرقات في الماء لإزالة الطعام من سطح الجسم. ضع اليرقات النظيفة على قطعة صغيرة من ورق الأنسجة المبلل في طبق بيتري صغير بدون غطاء ووضع طبق بيتري الصغير في طبق بيتري كبير يحتوي على قطعة من ورق الأنسجة الجافة. في غطاء محرك السيارة الكيميائي، استخدم ماص نقل البلاستيك لتطبيق 160 إلى 240 ميكرولترات من الأيزوفلوران على ورق الأنسجة الجافة وإغلاق غطاء طبق بيتري الكبير.
انتظر من دقيقتين إلى ثلاث دقائق أثناء مراقبة اليرقات. بمجرد أن تتوقف خطاطيف الفم عن الحركة ، أخرج اليرقات من طبق بيتري الكبير. ضع اليرقات المُشلّة على الغراء فوق البنفسجي بين الأشرطة المزدوجة على زلة الغلاف مع بشرة الظهر التي تواجه زلة الغطاء.
غطي كل يرقة بغطاء PDMS وتناسب جذع اليرقة في أخدود PDMS. اترك الرأس وذيل اليرقة خارج أخدود PDMS. تجنب منع الأبراج من اليرقة من الغراء.
اضغط لأسفل على نهايات كتلة PDMS على الشريط مزدوج الوجه دون تطبيق القوة على الأخدود. سحب بلطف على ذيل اليرقة لتسطيح بشرة تحت PDMS. ارتداء نظارات السلامة واستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة لعلاج الغراء الأشعة فوق البنفسجية لمدة أربع دقائق على الإعداد عالية.
الوجه الغطاء تنزلق رأسا على عقب واستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية لعلاج الغراء الأشعة فوق البنفسجية لمدة أربع دقائق أخرى. ضع قطعة صغيرة من ورق العدسة بحجم 15 في 30 ملليمتر في قاع غرفة التصوير. ترطيب الورق مع 20 إلى 30 ميكرولترتر من الماء.
ضع زلة الغطاء على الغرفة بحيث تواجه اليرقات داخل الغرفة. استخدام الغراء الأشعة فوق البنفسجية للتمسك طرفي زلة الغطاء إلى السطح المعدني. الجانب الظهري لليرقات جاهز للتصوير تحت مجهر مشترك.
بعد التصوير، قم بإزالة الزيت على زلة الغطاء العلوي باستخدام ورق العدسة. فصل زلة الغطاء العلوي من الإطار المعدني عن طريق قطع في الفضاء بين زلة الغطاء والإطار المعدني مع شفرة حلاقة. غرفة التصوير جاهزة لإعادة الاستخدام.
فصل التكعيب PDMS من زلة الغطاء العلوي مع ملقط. لفة التكعيبات PDMS على شريط لزج لإزالة بقايا الغراء والغبار. التكعيب PDMS جاهزة لإعادة الاستخدام.
في هذا البروتوكول ، تم شل يرقات الدوزوفيا لمدة أطول من 10 ساعات للتصوير المستمر. يُظهر هذا الرقم ست يرقات متأخرة من الدرجة الثالثة مثبتة في الغرفة. تم إصلاح جذوع اليرقات بينما كانت رؤوسها وذيولها حرة في التحرك.
هنا، ونحن نبرهن على تطبيق LarvaSPA في دراسة ديناميات dendrite العصبية وانحطاط التشعب باستخدام الخلايا العصبية DA فئة أربعة كنموذج. لشل حركة اليرقات بنجاح باستخدام هذه الطريقة ، من المهم التوقف عن تعريض اليرقات لisoflurane بمجرد توقف خطاطيف الفم عن الحركة وعلاج الغراء فوق البنفسجي قبل أن تستيقظ اليرقات تمامًا. لدراسة انحطاط التشعب والتجدد ، يمكن إجراء إصابة الليزر عندما يتم شل حركة اليرقات في غرفة التصوير.
وقد ساعدتنا اليرقات على فهم كيف تفشل التشعبات المتنامية الديناميكية في اضمحلال الخلايا الجلدية مثل في بروتيوغليكان الخلايا الكبدية وكيف يتعرض فوسفاتيديلسيرين على dendrites المنحنية المنحنية المنحطة بعد إصابة الليزر. حماية العينين بنظارات السلامة أثناء استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية. وينبغي أن يتم ضرب اليرقات باستخدام ايزوفلوران في غطاء الدخان.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة LarvaSPA، وهي طريقة مبتكرة للتصوير الحي المستمر ليرقات Drosophila السليمة لمدة تزيد عن 10 ساعات. صُممت هذه التقنية لتسهيل استقصاء العمليات البيولوجية الديناميكية، لا سيما في العصبونات الحسية الطرفية وتطور التغصنات الشجيرية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال البحث
- بيولوجيا الخلية
- البيولوجيا التنموية
- المجهرية
خلفية علمية
- الحاجة إلى التصوير طويل الأمد في أنظمة اليرقات الحية.
- فهم العمليات الخلوية القريبة من جدار جسم اليرقة.
- التحديات المرتبطة بتثبيت اليرقات لفترات ممتدة.
الطرق المستخدمة
- التصوير الحي المستمر باستخدام مكعبات PDMS مصممة خصيصاً.
- يرقات Drosophila كنموذج بيولوجي.
- تقنيات تصوير عالية الدقة باستخدام المجهر البؤري (confocal microscope).
النتائج الرئيسية
- تثبيت ناجح لعدة يرقات لجلسات تصوير طويلة الأمد.
- القدرة على تصور تطور التغصنات وتدهورها.
- كشف كيفية تغير أنماط التغصنات بمرور الوقت نتيجة للسلوكيات قصيرة المدى.
الاستنتاجات
- تعرض هذه الطريقة طفرة في تقنيات التصوير لدراسة التطور العصبي لليرقات.
- تعزز فهم الديناميكيات الخلوية الأساسية في كائن نموذجي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التصوير الحي طويل الأمد للكائنات النموذجية السليمة تقليل المخاطر الآلية في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال الكشف عن العمليات الخلوية الديناميكية التي تدعم التحقق من الأهداف والمسح المظهري. ويدعم نظام LarvaSPA الثقة التنبؤية في أبحاث النمو العصبي والتنكس العصبي من خلال توفير بيانات زمنية عالية الدقة حول ديناميكيات الشجيرات العصبية على فترات ممتدة. وتتماشى هذه القدرة مع تحسين النماذج قبل السريرية واكتشاف المؤشرات الحيوية الانتقالية في اضطرابات الجهاز العصبي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية في مسارات التطور والتحلل العصبي باستخدام أنظمة عصبية يرقية سليمة.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق من صحة الأهداف الوظيفية من خلال تصور الاستجابات الشجيرية في الوقت الفعلي للاضطرابات الجينية أو الدوائية.
- القيمة التنبؤية: تعزز الثقة في تحديد المركبات الرائدة من خلال ربط سلوكيات التفرع قصيرة المدى بالتغيرات الهيكلية طويلة المدى في العصبونات الحسية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير عينات يرقات موحدة وقابلة للتكرار للفحص الكمي للمركبات التي تؤثر على نمو أو استقرار الاستطالات العصبية.
- القيمة التشغيلية: تتيح التصوير المتعدد لست إلى تسع يرقات في كل حجرة، مما يزيد من إنتاجية فحص الاستجابة للجرعة أو الفحص الجيني.
- جاهزية المقايسة: توفر ظروف تصوير مستقرة وطويلة الأمد تتوافق مع قراءات المجهر البؤري للحصول على ملاحظات نمطية مستمرة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يربط بين ملاحظات الاكتشاف في عصبونات Drosophila والنماذج الثديية للأمراض العصبية التنموية والتنكسية العصبية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يكشف كيف تساهم ديناميكيات التشجرات قصيرة المدى في الاعتلالات المرضية طويلة المدى، مما يوجه تقييمات سلامة الأهداف في المراحل المبكرة.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: يسهل دراسة تعرُّض phosphatidylserine وفشل التعصيب البشروي كمؤشرات حيوية ترجمية محتملة للإجهاد أو الإصابة العصبونية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضيات الأهداف وصولاً إلى تحسين المركبات الرائدة، ولا سيما في مسارات العمل التي تركز على العلوم العصبية والتي تتطلب قراءات مظهرية ديناميكية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم توضيح المسارات والحد من المخاطر البيولوجية في نماذج العصبونات الحسية الجسدية من خلال تمكين التصوير المزمن للتفرع الشجري والتنكس في التغصنات.
- الفحص: توفر توحيداً للمقايسات ومخرجات كمية ضرورية لمقارنة تأثيرات المركبات على ديناميكيات الزوائد العصبية عبر ظروف مختلفة.
- التحليلات: تولد مجموعات بيانات زمنية ومكانية عالية الدقة تتيح للفرق ربط السلوكيات دون الخلوية بالنتائج المظهرية بمرور الوقت.
- الأبحاث الانتقالية: تربط المظاهر العصبية في اليرقات بنماذج الأمراض قبل السريرية من خلال آليات محفوظة للحفاظ على التغصنات والاستجابة للإصابة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تضع غرفة التصوير ومكعبات PDMS كمكونات منصة قابلة لإعادة الاستخدام، مما يقلل التكلفة لكل تجربة ويدعم تصميمات الدراسات الطولية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: ثقة تنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال الملاحظة المباشرة لديناميكيات نمو وتدهور الزوائد الشجيرية.
- القيمة التشغيلية: التقييس، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع عبر مكعبات PDMS القابلة لإعادة الاستخدام وتصميم غرفة تصوير نمطية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المتابعة أو الإيقاف في برامج التدهور العصبي من خلال تقليل الغموض الآلي في اللدونة الهيكلية العصبية.
- التأثير على المحفظة: يتيح تحديد أولويات الأهداف المعدلة حسب المخاطر بناءً على بيانات نمطية طولية من أنظمة يرقانية سليمة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع ذباب Drosophila، والمجهر البؤري (confocal microscopy)، وتقنيات التصنيع الدقيق القائمة على الأشعة فوق البنفسجية (UV).
- يعتمد على توفر المجففات بالتفريغ (vacuum desiccators)، والحاضنات الحرارية، وأدوات القطع الدقيقة لتصنيع مكعبات PDMS.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يخص تحديد مراحل اليرقات، وتوقيت التثبيت، وتجميع غرفة التصوير لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند تطبيق الطريقة على مراحل يرقية مختلفة أو أنواع فرعية من الخلايا العصبية بخلاف الخلايا العصبية da من الفئة IV.
- يشمل قيوداً عملية مثل ضرورة تجنب انسداد الثغور التنفسية (spiracle blockage) والتوقيت الدقيق للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (UV curing) بالنسبة لفترة تعافي اليرقات من تأثير isoflurane.
