مجتمعة الضربة القاضية المشروطة وتكييف المجال تشكيل الفحص لدراسة جين الجذعية المرتبطة بالخلايا الجذعية سرطان المعدة المستمدة من المريض
مايو 9, 2020
في هذا البروتوكول، نقدم تصميم تجريبي باستخدام نظام الضربة القاضية المشروطة ومقايسة تشكيل الكرة المكيفة لدراسة تأثير التكتل على جذع GCSCs المشتق من المريض. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة كل من في المختبر وفي وظيفة الجسم الحي للجينات المرتبطة بالرباط في أنواع مختلفة من CSCs.
وتورط الخلايا الجذعية السرطانية في السرطان انتكست الانبثاث على مقاومة المخدرات. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة للتحقيق في وظائف الجينات الرئيسية في الخلايا الجذعية السرطانية. باستخدام نظام الضربة القاضية المشروطة وتكييف المجال تشكيل الحسبة، يتم تكييف هذه الطريقة بسهولة لدراسة في المختبر وفي وظائف الجسم الحي على الجينات المرتبطة الجذعية في أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية السرطانية.
مما يدل على الإجراء ، وسوف يكون Yuting لي وشيانجيو تان ، ومساعدي البحوث من مختبري. لتوليد جزيئات فيروس العدس، بذور أربعة ملايين 293T خلايا التعبئة والتغليف العدسي في طبق بيتري 100 ملليمتر مع 10 ملليلتر من DMEM تكملها 10٪ FBS. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والتأكد من أن الخلايا هي 50 إلى 80٪ التقاء في يوم النقل.
جلب انخفاض في درجة حرارة المصل من المتوسط إلى درجة حرارة الغرفة وإعداد أنابيب A و B وفقا لاتجاهات المخطوطات. إضافة محتويات أنبوب A إلى أنبوب B.Mix جيدا واحتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإعداد مجمعات الدهون والحمض النووي. إزالة خمسة ملليلترات من المتوسطة من طبق ثقافة الخلية.
ثم إضافة خمسة ملليلتر من مجمع الدهون والحمض النووي في طبق ثقافة الخلية إسقاط الحكمة ودوامة بلطف الطبق. احتضان طبق الثقافة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة، وإزالة بعناية وسيط transfection واستبدالها مع 10 ملليلتر من DMEM قبل الدافئة تكملها مع 10٪ FBS.
احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. ما يقرب من 48 ساعة بعد transfection، حصاد 10 ملليلتر من فيروس العدس التي تحتوي على عظمى وتصفية لهم مع 0.45 ميكرومتر صب مرشح لإزالة الحطام الخلوي. جميع الأوعية ثقافة الخلية، نصائح، والمرشحات والمحاقن قد تحتوي على فيروس العدس وينبغي أن تعامل مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها.
نقل مُنَحَّد مُوضح إلى حاوية معقمة. أضف تركيز Lenti-X واخلطه مع انعكاس لطيف. احتضان الخليط في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
وفي اليوم التالي، تمّت الطرد المركزي في 1500 مرة من G لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية. إزالة بعناية فائقة، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه في الجزء السفلي. بلطف إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من DMEM تكملها 10٪ FBS وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.
بذور 6 ملايين الخلايا الجذعية سرطان المعدة أو GCSC في طبق بيتري 100 ملليمتر مع 10 ملليلتر من DMEM تكملها 10٪ FBS. زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ التقاء, التعرق المتوسطة من الطبق وإضافة جزيئات الرونتيفيرال المركزة المخففة مع أربعة ملليمترات من المتوسط DMEM كاملة, تحتوي على كاشف بوليبرين.
إعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة 18 ساعة. يجب اختبار البوليبرين في ظروف مختلفة لتحديد التركيز الفعال ، والذي عادة ما يكون في حدود 2 إلى 10 ملليغرام لكل ملليلتر. بعد 18 ساعة، استبدل الوسيط بـ 10 ملليلتر من DMEM بنسبة 10٪ FBS و أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.
ثم، الطامح مع مكبر مع حطام الخلية وإضافة DMEM جديدة تكملها 10٪ FBS و 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من Puromycin. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. ثم, تغيير المتوسطة مرة أخرى إلى DMEM جديدة تكملها 10٪ FBS وخمسة ميكروغرام لكل المليلتر Puromycin.
بعد حضانة أخرى لمدة 24 ساعة ، شطف GCSC المنضم مرتين مع خمسة ملليلتر من DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. افصل الخلايا بميليلتر واحد من محلول تفكك الخلايا المدفأة قبل ذلك واحتضانها لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم، إضافة خمسة ملليلتر من الطازجة قبل warmed GCSC ثقافة كاملة متوسطة إلى تعليق الخلية.
الاستغناء عن ثلاثة ملليلترات من هذا التعليق في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر للتبريد، وثلاثة ملليلترات أخرى في أنبوب آخر لالتحريض مع doxycycline. جهاز طرد مركزي كلا الأنابيب في 800 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم, الطامح من أنبوب B وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الطازجة قبل الدافئة GCSC ثقافة كاملة المتوسطة.
بذور عدد مناسب من الخلايا في طبق جديد بيتري 100 ملليمتر مع 10 ملليلتر من الطازجة قبل الدافئة GCSC ثقافة كاملة المتوسطة و 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر doxycycline. ثم، احتضان الطبق لمدة 48 ساعة. استخدم عداد الخلايا التلقائي لتحديد كثافة عينة من الخلايا سعة 10 ميكرولتر.
ثم، ضبط وحدة التخزين مع GCSC قبل warmed كامل ثقافة المتوسطة للحصول على تركيز 20،000 الخلايا القابلة للحياة لكل ملليلتر. الاستغناء 100 ميكروليتر من تعليق الخلية في كل بئر من جديد, مرفق منخفضة جدا 96 جيدا لوحة الثقافة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
يجب أن يحدث تشكيل المجال في غضون ثلاثة إلى 10 أيام. صورة تكوين مجال الورم كل يومين. تم زرع الخلايا الجذعية لسرطان المعدة من غدية المعدة البشرية الأولية في وسط الثقافة الخالية من المصل.
بعد ستة أيام، توسعت الخلايا من الخلية المفردة مثل النمط الظاهري إلى المجالات الكبيرة. لتقييم وظيفة التكتل في GCSCs، تم استنساخ تسلسلات دبوس الشعر القصير ضد التكتل في متجه Tet-GV307-RFP-Puro. تم علاج الخلايا التي تنقلها مع ناقلات التعبير مع doxycycline لمدة 48 ساعة.
ثم تم التحقق من تعبير التكتل بواسطة لطخة غربية وتم تحديدها كمياً حسب قياس الكثافة. وجود doxycycline وضربة قاضية من التكتل في GCSCs منعت تكوين مجال الورم. في حين لم يلاحظ أي تثبيط لتشكيل مجال الورم في الخلايا التي تم تحويلها مع الضوابط SHRNA مخفوقة, مشيرا إلى أن doxycycline وحدها لا تمنع تكوين مجال الورم.
وتشير هذه النتائج إلى أنه بعد تكتل إسكات, GCSCs تنمو ببطء ولا يمكن أن تشكل مجالات الورم. وبناء على هذه البيانات، يلعب التكتل دوراً حاسماً في تعزيز نشاط التجديد الذاتي لـ GCSCs، مما يشير إلى أنه يمكن أن يكون هدفًا واعدًا للأدوية لقمع الخلايا الجذعية السرطانية في مرضى سرطان المعدة. يجب أن تكون مجالات الأورام هياكل مستديرة صلبة على خلايا فردية أو مجمعة ، لا ينبغي اعتبارها مجالات ورم.
ومع ذلك، قد لا تشكل بعض الخلايا الجذعية السرطانية هياكل نموذجية في مجال الأورام. يمكن اتباع هذا الإجراء مع طرق أخرى لفحص الخلايا الجذعية السرطانية لإمكانات متجددة في المختبر. على سبيل المثال، يمكن دراسة التعبير عن العلامات المرتبطة بالرّكة.
ويمكن توسيع نطاق البروتوكول لدراسة وظائف الجينات الحرجة في الخلايا الجذعية السرطانية مثل الجذعية على البقاء على قيد الحياة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول تصميمًا تجريبيًا باستخدام نظام تقليل مشروط واختبار تكوين الكرات المعدل لدراسة تأثير السترولينات على خصائص الخلايا الجذعية لخلايا سرطان الغدد اللعابية المشتقة من المرضى. يمكن تعديله بسهولة لكل من الدراسات المخبرية والحيوية لدراسة الجينات المرتبطة بالخلايا الجذعية في أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية السرطانية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا السرطان
- أبحاث الخلايا الجذعية
- تحليل وظيفة الجينات
الخلفية
- تسهم الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) في انتكاس السرطان والانبثاث.
- فهم دور الجينات المحددة في الخلايا الجذعية السرطانية أمر بالغ الأهمية لتطوير العلاجات المستهدفة.
- يركز هذا البروتوكول على جين الستروليتين وتأثيره على خصائص الخلايا الجذعية.
- تسمح الطريقة بالتطبيق المرن في أنواع مختلفة من السرطان.
هدف الدراسة
- للتحقيق في دور الستروليتين في خصائص الخلايا الجذعية لخلايا سرطان الغدد اللعابية المشتقة من المرضى.
- لتوفير طريقة موثوقة لدراسة الجينات المرتبطة بالخلايا الجذعية.
- لتعزيز فهم بيولوجيا الخلايا الجذعية السرطانية والأهداف العلاجية المحتملة.
الطرق المستخدمة
- نظام تقليل مشروط لتسكين الجينات.
- اختبار تكوين الكرات المعدل لتقييم خصائص الخلايا الجذعية.
- تصميمات تجريبية مخبرية وحيوية.
- استخدام الجزيئات الفيروسية اللنتية لتسليم الجينات.
النتائج الرئيسية
- أظهر الإجراء لتوليد جزيئات الفيروس اللنتي.
- قدم رؤى حول تأثيرات الستروليتين على خلايا سرطان الغدد اللعابية.
- أظهر قابلية التطبيق للطريقة لمختلف أنواع الخلايا الجذعية السرطانية.
- أبرز أهمية دراسة الجينات المرتبطة بالخلايا الجذعية.
الخلاصات
- البروتوكول فعال لدراسة دور الستروليتين في الخلايا الجذعية السرطانية.
- يمكن تعديله لأنواع مختلفة من الخلايا الجذعية السرطانية.
- قد تؤدي هذه الدراسة إلى رؤى جديدة في استراتيجيات علاج السرطان.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of stemness-associated genes in patient-derived gastric cancer stem cells, supporting target validation in oncology discovery. By combining conditional knockdown with an adapted sphere formation assay, it provides quantitative, reproducible readouts for assessing gene function in cancer stemness pathways. The approach enhances predictive confidence in early-stage target selection and portfolio prioritization for gastric cancer therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking clusterin knockdown to reduced sphere formation, clarifying its role in GCSC self-renewal.
- Operational Value: Enables functional target validation through inducible, reversible gene silencing in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports preclinical go/no-go decisions by demonstrating that clusterin inhibition impairs tumorigenic potential in vitro.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable sphere formation metrics suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Uses lentiviral delivery and puromycin selection to ensure consistent knockdown efficiency across experiments.
- Scalability: Compatible with 96-well ultra-low attachment plates, enabling parallel testing of multiple genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses patient-derived gastric cancer stem cells, maintaining phenotypic fidelity to human tumor biology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro stemness assessment with potential in vivo validation of clusterin as a therapeutic target.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic evidence to prioritize clusterin in preclinical pipelines targeting cancer stem cell-driven relapse and resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling target validation after initial hit identification and before lead optimization in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking gene knockdown to functional stemness outcomes via sphere formation.
- Screening: Generates quantitative, imaging-based readouts that can be automated for compound or genetic suppressor screens.
- Analytics: Enables densitometric analysis of Western blots and sphere quantification for objective comparison of genetic conditions.
- Translational Research: Connects in vitro stemness phenotypes to potential in vivo models through conserved assay adaptability.
- Enterprise Reuse: The conditional knockdown-sphere formation platform is reusable across stemness-associated genes and cancer types beyond gastric cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stemness gene function through inducible, reversible knockdown in primary-derived cells.
- Operational Value: Standardizes stemness assessment via sphere formation, improving inter-lab reproducibility and assay transferability.
- Strategic Value: Increases confidence in target selection by providing causal evidence linking gene suppression to loss of tumorigenic potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets like clusterin based on functional validation in patient-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral production, cell culture, and molecular biology techniques including transfection and selection.
- Depends on access to ultra-low attachment plates, automated cell counters, and Western blotting infrastructure for validation.
- Necessitates standardization of doxycycline induction and puromycin selection timing across laboratories for consistent knockdown.
- Requires optimization of polybrene concentration and lentiviral titer for efficient transduction of primary gastric cancer stem cells.
- Limited by the dependency on sphere formation as a stemness readout, which may not capture all stemness phenotypes in heterogeneous cultures.
