طريقة سريعة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف لأقسام الأنسجة المجمدة

هذه الطريقة مفيدة للكشف عن العلامات الحيوية المتعددة في عملية اكتاريب واحدة بما في ذلك علامات غير قابلة للكشف عادة في أقسام البارافين، والمشاركة في توطينها. باستخدام هذه الطريقة التلطين التجريبية ، يتم تقليل وقت التلطخ بشكل كبير ويمكن إجراء هذه الطريقة في أي مختبر. إظهار هذه الطريقة سيكون دينيش جايشانكار.

وهو ما بعد الدكتوراه الماهرة من المختبر، وأيضاً مركز تقييم العلاج المناعي، مدير المرافق. عند اختيار الأجسام المضادة للتحليل، ضع في اعتبارك مجموعات الإثارة وتصفية الانبعاثات المتاحة على نظام التصوير شبه الآلي. وبعد اختبار مجموعات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية الفلوروفور، إعداد الفلوروفورس لاستخدامها بحيث يكون لديك الحد الأدنى من التداخل الطيفي على النحو المقترح في الجدول.

لتلطيخ متعددة، وإعداد مزيج من الأجسام المضادة مع الفلوروفورات متوافقة في الأوهام الأمثل المحددة سلفا، وإضافة كوكتيل إلى أقسام الأنسجة من الفائدة. بالنسبة لتلوين العلامة الواحدة، أضف الأجسام المضادة المترافقة الأولية فقط إلى الشريحة. لجميع البقع، وتشمل شريحة غير المقعة التحكم التي تخضع لنفس الإجراء تلطيخ دون إضافة الأجسام المضادة مترافق الأولية.

بعد فترة حضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء، وغسل الشرائح مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل. بعد الغسيل الثاني ، وصمة عار مضادة الشرائح الملون متعددة مع DAPI لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء ، تليها اثنين من يغسل لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني. لإنشاء مكتبة طيفية، قم بتعيين قوة المصباح لنظام التصوير متعدد الأطياف إلى 100٪ وفتح برنامج تشغيل المجهر.

حدد تحرير البروتوكول والبروتوكول الجديد. أدخل اسم بروتوكول وحدد الفلوريسنس ضمن وضع التصوير. ثم قم بتوفير اسم الدراسة، وقم بتحميل الشرائح الملطخة على المسرح.

انقر فوق تحرير التعريض الضوئي، واستخدم خيارات التركيز التلقائي والفضح التلقائي لضبط أوقات التعرض والحصول على لقطات للشرائح الملطخة المفردة. بعد تصوير الشرائح الملطخة، احفظ البروتوكول. وفي برنامج التعلم الآلي تحت علامة التبويب مكتبة البناء ، قم بتحميل كل صورة ملطخة.

حدد الكلمة المناسبة وانقر فوق استخراج. سيقوم البرنامج باستخراج الإشارة الفلورسنت المحددة في الطابق. لحفظ اللون المستخرج، انقر فوق حفظ لتخزين.

قد يتم إنشاء مجموعة جديدة أو يمكن تخزين اللون المستخرج إلى مجموعة موجودة. للتصوير متعدد الأطياف، بمجرد إنشاء المكتبة الطيفية والتحقق منها، ضبط أوقات التركيز والتعرض على الشريحة الملون متعددة الأطياف كما هو موضح، وفتح الشرائح الممسوحة ضوئيا لإنشاء مهمة جديدة. قم بتوفير معرف شريحة وحدد بروتوكول.

ضمن المهمة، حدد مسح كامل للشريحة لإجراء مسح كامل للشريحة على الشريحة الملطخة المتعددة. في صورة مسح الشرائح بالكامل، حدد المناطق التي تهمك عبر الصورة. وسيتم مسح هذه المناطق باستخدام أوقات التعرض المحددة سابقاً على الشريحة المتعددة لاستخدامها في فك التكتّن والتحليل الطيفي.

في برنامج التشغيل المجهر، حدد الحصول على حقول MSI ضمن المهمة، ثم انقر فوق "عملية الشريحة" للحصول على مناطق ذات أهمية في تكبير 20x. مرة واحدة تم الحصول على المناطق ذات الاهتمام ، في برنامج التعلم الآلي ، انقر فوق ملف وفتح تحت علامة التبويب التحليل اليدوي لتحميل الصور الملون متعددة. حدد مصدر المكتبة الطيفية، وانقر فوق تحديد طوابق لاختيار المكتبة الطيفية المحفوظة مسبقاً.

انقر فوق ملف وفتح لتحميل الصورة غير المُطَرَّة. ثم انقر فوق أيقونة علامة الحبر التلقائية للفلورس وارسم خطًا أو منطقة على الشريحة غير المُطَوَّقة لتحديد الفلورة التلقائية داخل الأنسجة. ثم ضمن علامة تحرير والألوان علامة التبويب، تعيين أسماء لكل علامة وانقر فوق إعداد الكل.

بعد التحقق من الصورة غير المُزكَم بالمطياف، في برنامج التعلم الآلي، حدد غشاء السيتوبلازم وخيارات العلامة من اللوحة. وباستخدام زر القطع، حدد استخدام هذه الإشارة للعثور على، لتكوين العلامة لاكتشاف إما النوى، السيتوبلازم أو الغشاء. عندما يتم اختيار علامة cytoplasmic أو غشاء، حدد استخدام إشارة للمساعدة في الخيار تقسيم النووية.

البرنامج سوف تلقائيا الكشف عن وخلق أقنعة الفردية للنواة، السيتوبلازم والغشاء. استخدم طريقة عرض علم الأمراض لعلامة معينة وخيارات التكوين في البرنامج لضبط الأقنعة، وانقر على مقطع الكل لإنشاء خريطة تجزئة الخلايا. بعد تجزئة الخلية، حدد علامات إلى الظاهري الخلايا الإيجابية.

بالإضافة إلى ذلك، حدد على الأقل خمس خلايا التي لا تلطخ مع علامة المختارة إلى الظاهري الخلايا السلبية. ثم انقر فوق "Classifier Train" لتدريب البرنامج على الكشف تلقائيا عن جميع الخلايا الملطخة مع علامات المحددة داخل الصورة. سيتم إنشاء مخطط ظاهري.

كما توضح هذه الصور، يمكن استخدام الأجسام المضادة التي تم التحقق منها لإجراء عملية استئصال خلايا التدفق لتصور تلطيخ الأنسجة باستخدام مرشح قابل للبلورة السائلة في نظام التصوير شبه الآلي. هنا يمكن ملاحظة صورة غير مُزكَّتة من اللوزتين البشرية المجمدة التي تشمل وضع علامات على الخلايا البائية والخلايا المتكاثرة داخل مركز الجرثومي الجرامي، ومنطقة الخلايا التائية الجريبة البينية. يسمح خيار مناظر علم الأمراض بالتصور لنمط التلطخ الفردي لكل علامة داخل الأنسجة ذات الاهتمام ، مما يشير إلى أن طريقة تلوين متعددة والتصوير الطيفي تعمل على الأنسجة المجمدة.

كما هو موضح في قسم ورم الماوس المجمدة، التصوير متعدد الأطياف يمكن أيضا أن تستخدم لتصور الورم التسلل الخلايا التائية، وغيرها من نسب الخلايا النخاعية بما في ذلك الضامة المرتبطة بالورم. ويمكن توليد تجزئة الخلايا وخرائط النمط الظاهري ، وعدد الخلايا الملطخة لكل علامة تم تحليلها بواسطة البرنامج ، مما يدل على أنه يمكن استخدام البرنامج في القياس الكمي للتلوين متعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة. بالنسبة لشخص جديد 6to هذه التقنية ، من المهم التعرف على الميزات المحددة لفلوروكروماتك ، وإعداد شرائح مكتبة عالية الجودة للتركب الطيفي مع الحد الأدنى من التداخل الطيفي.

من المهم أيضًا إجراء معايرة الأجسام المضادة. في رأينا، يمكن لهذه الطريقة توفير معلومات حول فعالية العلاج المناعي للسرطان والتطبيقات العلاجية الأخرى، لا سيما عندما يكون التوقيت هو الجوهر.