استجواب مواز لـ α-Arrestin2 تجنيد لـ Ligand الفحص على نطاق GPCR على نطاق واسع باستخدام PRESTO-Tango assay

وقد وضعت منصة بريستو تانجو لتنفيذ استجواب بالتوازي وفي وقت واحد من جميع GPCRs غير مُعدة في الجينوم البشري، بما في ذلك أن الأهداف اليتيمة لفرز الاعتقال بيتا-2 الناجمة عن اللغمة. منصة بريستو تانجو هي المورد الوحيد المفتوح المصدر لتوصيف الجينوم GPCR بأكمله في نهج مواز، وذلك باستخدام اختبار التوظيف بيتا-الاعتقال المستقلة بروتين G. مما يدل على المعالج سيكون جنفياف لاروش باحث مشارك في مختبري ، ومانيل Zighal ، وهو مرشح دكتوراه في مختبري.

قبل البدء في العملية إضافة 20 ميكرولتر من 25 ميكروغرام لكل ملليلتر بولي-L-lysine حل لكل بئر من العدد التجريبي المناسب من 384 لوحات القاع البصرية واحتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين. في نهاية الحضانة، نفض الغبار لوحات على الحوض لإزالة الزائدة بولي-L-ليسين وإضافة 40 ميكرولترات من محلول مضاد للمضادات الحيوية لكل بئر. ثم احتضان اللوحات اللازمة لبذات الخلايا في 37 درجة مئوية ووضع بقية لوحات في أربع درجات مئوية لتخزين على المدى الطويل.

لذر بذور خلايا HTLA للفحص الأولي، شطف بلطف التقاء 150 ملليمتر الثقافات الخلية مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل معالجة الثقافات مع ستة ملليلتر من 0.05٪التربسين EDTA لكل طبق. عندما يكون الخلايا منفصلة تجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على وحدة تخزين متساوية من DMEM. وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

إعادة تعليق بيليه في 2.2 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تركيز DMEM ونفض الغبار لوحات على الحوض لإزالة محلول مضاد للمضادات الحيوية. انقر على لوحات لتجف والبذور 45 ميكرولترات من الخلايا في كل بئر. ثم ضع اللوحات عند 37 درجة مئوية و 45٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها.

لإعداد 384 جيدا الحمض النووي مصدر لوحة لtransfection توزيع 50 نانوغرام لكل ملليلتر من كل بلازميد ترميز الحمض النووي مجانا 96 96 جيدا 96 لوحة. استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل يدويا 10 ميكرولترات من حل الحمض النووي من كل بئر من 96 بئر لوحة إلى آبار فردية من واحد 384 جيدا الحمض النووي مصدر لوحة في رباعية لكل حالة كما هو موضح. بعد ذلك، نقل 40 ميكرولترات من محلول كلوريد الكالسيوم 0.313 المولر إلى كل بئر من صحن مصدر الحمض النووي وخلط محتويات كل بئر بلطف.

إضافة 50 ميكرولترات من 2x HEPES العازلة إلى كل بئر من 384 جيدا الحمض النووي مصدر لوحة مع خلط لطيف. بعد نقل دقيقة واحدة 10 ميكرولترات من خليط الحمض النووي من 384 جيدا الحمض النووي مصدر لوحة إلى كل بئر من خلايا HTLA المصنفة واحتضان الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي decant الخلية العابرة المتوسطة وإضافة ببطء 40 microliters من المتوسط تجويع إلى كل بئر مع الحرص على عدم لمس الخلايا مباشرة.

ثم إضافة 20 ميكرولترات من العازلة السيارة للصفوف بالتناوب دون مركب في 20 ميكرولترات من مجمع الفائدة في تركيز ثلاث مرات في الصفوف بالتناوب، قبل أن يعود لوحة إلى الحاضنة ثقافة الخلية. 16 إلى 24 ساعة بعد التحفيز 1000000 10000 1000000 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ثم قراءة لوحات على منضدة الإنارة لوحة صغيرة مع وقت التكامل من ثانية واحدة في بئر.

للفحص الثانوي، وزراعة فرعية الخلايا HTLA في أطباق 100 ملليمتر في خمس مرات 10 إلى الخلايا الستة إجمالي كثافة الخلايا في 11 ملليمتر من المتوسط الكامل لكل طبق لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، مختلطة 10 ميكروغرام من الحمض النووي GPCR مجانية مع 500 ميكرولترات من محلول كلوريد الكالسيوم تريس-EDTA مع دوامة تليها إضافة 500 ميكرولترات من العازلة HEPES. بعد اهتزاز قوي، احتضان الحل لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وعلى الفور إضافة ملليلتر واحد من الحل إسقاط الحكمة على الخلايا.

صخرة بلطف لتوزيع الترسبات بالتساوي ووضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، تحقق من كفاءة النقل تحت صورة خلية فلورية. المعاملات التي تزيد عن 50٪ من التغطية مثالية.

شطف بلطف الخلايا المصابة مع حل الآية قبل فصل الخلايا مع ثلاثة ملليلتر من 0.05٪تريبسين EDTA. جمع الخلايا المتفككة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في أربع مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من التركيز المتوسط الجائع. ثم بذور 45 ميكرولترات من الخلايا في كل بئر من بولي L-ليسين مشفرة 384 لوحة جيدا ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع ساعات على الأقل.

لإعداد نصف سجل لوحة استجابة الجرعة منحنى إضافة 270 microliters من HBSS تستكمل مع HEPES والمضادات الحيوية المضادة للمضادات الحيوية للجميع ولكن الصف الأخير من لوحة 96 جيدا وإضافة 30 ميكرولترات من كل محلول المخدرات عالية ومنخفضة لآبار الصف H.Transfer الحل من كل بئر من الصف H في بئر المقابلة من الصف G مع خلط والاستمرار في تخفيف المسلسل مركبات المخدرات حتى الصف الأخير من لوحة يتم الوصول. باستخدام التخطيطي كمرجع، مزيج 20 ميكرولترات من التخفيفات العمود المنخفض من الصفوف A إلى G من لوحة 96 بئر و 20 ميكرولترات من التخفيفات العمود عالية إلى الآبار B خلال H من لوحة البئر 96 إلى لوحة البئر 384 الجالسة سابقا. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 16 ساعة.

16 إلى 24 ساعة بعد التحفيز 1100000 1200000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 في هذه التجربة التمثيلية، من أصل 168 GPCRs التي تم استجوابهم في الفحص الأولي، فقط مستقبلات الدوبامين D3 وOPSIN 5 كانت المتنافسين كأهداف نشطة محتملة. أنتجت مستقبلات الدوبامين D3 تغيير log2 أضعاف كبيرة من 4.7 في حين أن opsin 5 أنتجت استجابة أقل قليلا من 2.39.

على سبيل المقارنة, الدوبامين مستقبلات D2, التحكم الإيجابي للشاشة الأساسية أنتجت تغيير log2 أضعاف 4.58. وأظهرت منحنيات الاستجابة تلك من الفحص الثانوي أن استخراج حبيبات الكروماتين تنتج نوافذ إشارة مماثلة في قيم تركيز فعالة نصف قصوى إلى quinpirole تؤكد صحتها كضربة نشطة في مستقبلات الدوبامين D3. تم إنتاج منحنى جرعة مسطحة مماثلة للسيطرة السلبية لopsin 5 ولكن استبعاد هذا المستقبل كهدف ممكن لاستخراج حبيبات الكروماتين. Presto-Tango يتطلب عناية خاصة كما variabilities في توزيع الخلايا، كفاءة transfection والتخفيفات المخدرات المسلسل يمكن أن يؤدي إلى خطأ مركب، والتي يمكن أن تؤثر على دقة البيانات.

يمكن استخدام الطرق المتعامدة مثل نهج الربط الإشعاعي ، ونقل الطاقة الرنين الحيوي والكالسيوم المتفاعل AMP واستيعاب الخضوع الوظيفي لتأكيد تفاعلات مستقبلات الليغمة ووصفها.