تحديد الفخاخ نيوتروفيل خارج الخلية في البارافين جزءا لا يتجزأ من الخيط الشرياني Thrombi باستخدام المجهر Immunofluorescence

يمكن أن يكون هذا البروتوكول ل parafinization متبوعاً باسترجاع مستضد من أقسام الأبهر المضمّنة من البارافين أداة مفيدة لدراسة دور الفخاخ العدلية ثلاثي الخلايا في تجلط القطط. إن الكشف عن الفخاخ العدلية ثلاثية الخلايا عن طريق الفلوروس المناعي في الأنسجة الثابتة والمضمونة من البارافين، هو أعلى من الدعامات النسيجية التقليدية مثل HNE، لأنه يسمح بالكشف المتزامن للحمض النووي أكثر أمانًا والبروتينات خارج الخلية. ويمكن استخدام هذا البروتوكول في نوع آخر من الخثرات وفي الأنواع البيطرية الأخرى.

تحديد الفخاخ العدلات خارج الخلية داخل الخثارة الشرايين القطط تشير إلى أنها قد تلعب دورا في تجلط الدم في القطط. البروتوكولات الواردة هنا هي مبادئ توجيهية. ونحن نشجع المحققين بقوة على تعديل مدة وظروف عملية استرجاع المستضدات لتوفير إشارة مرضية.

لاستخدام نظام آلي لتنفيذ إزالة الرضاعةفينية وإعادة ترطيب المقاطع على الشرائح الزجاجية، ضع الشرائح الزجاجية في رفوف. غمر تماما في المالحة 100 في المئة لمدة ثلاث دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين.

لا تشطف بين الخطوات. غمر تماما في انخفاض تركيزات الإيثانول في درجة حرارة الغرفة ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق لكل من. غمر تماما في المياه ديونيد لمدة دقيقتين وكرر مرة أخرى واحدة.

بعد العلاج مع TBST، ملء الخزان مع المياه ديونة ساخنة إلى 100 درجة مئوية. السماح لغرفة باخرة لتكدير لمدة 20 دقيقة. على لوحة الحرارة، تسخين محلول استرجاع المستضد المتاحة تجاريا التي تحتوي على تريس وEDTA في درجة حرارة 9.0 إلى 95 إلى 97 درجة مئوية.

تأكد من عدم غليه. Suberge الشرائح تماما في حل استرجاع المستضد ساخنة ومواصلة تطبيق التدفئة الخارجية عبر باخرة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة خمس دقائق.

الآن، ضع المقاطع في حظر المخزن المؤقت 1. احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة تحت هزاز لطيف بين 30 و 50 دورة في الدقيقة. دون غسل، وتطبيق الفور 100 ميكرولترات من الأرانب المخففة المضادة للجسم المضادة للجسم citrullinated H3 هيستون مباشرة على الشريحة.

ضع زلة غطاء على كل قسم للسماح بالتوزيع حتى لخليط الأجسام المضادة. احتضان لمدة 12 إلى 16 ساعة في أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف. بعد ذلك، قم بغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة خمس دقائق كل مرة.

لتطبيق الأجسام المضادة، استخدم الأنابيب وتوزيع بالتساوي 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة المضادة للماعز المضادة للأرنب مترافق إلى أليكسا فلور 488. تغطية الشرائح مع احباط القصدير واحتضان الشرائح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة تحت هزاز لطيف. بعد الغسيل مع TBST وفقا للمخطوطة، احتضان الأقسام في منع العازلة 2 بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية تحت هزاز لطيف.

حماية من الضوء. اغسل مع TBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. منع المقاطع في منع العازلة 3 كما فعلت سابقا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين تحت هزاز لطيف.

احتضان المقاطع مع biotin laded ployclonal أرنب المضادة للعدلات البشرية elastase الأجسام المضادة في أربع درجات مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة كما هو موضح سابقا. بعد الغسيل مع TBST احتضان الشرائح مع اليكسا فلور 594 Streptavidin Conjugate لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسلي مع TBST مرة واحدة لمدة خمس دقائق.

تطبيق 100 ميكرولتررس من الخليط محلول Autofluorescense Quenching مباشرة على أقسام لمدة دقيقة واحدة حسب تعليمات الشركة المصنعة. اغسل الشرائح على الفور مع TBST ست مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. تغطية كل شريحة مع 100 ميكرولترات من 300 نانومولار DAPI لمدة خمس دقائق في الظلام.

ثم يغسل مع TBST خمس مرات لمدة ثلاث دقائق في كل مرة. تطبيق قطرة من antifade تصاعد المتوسطة مباشرة على الشريحة الزجاجية المحيطة القسم. ضع غطاء زلة بلطف على القسم دون خلق أي فقاعات.

السماح للعينات لعلاج بين عشية وضحاها في الظلام في أربع درجات مئوية. لتحديد موقع خثرة، مسح الجمجمة إلى caudally على طول الشريان الأورطي، تشعب الأبهر وكل شريان femeral باستخدام المجهر النقيض المرحلة مع هدف 10x. أولاً، قم بفحص الأقسام الخاصة بالحمض النووي الخالي من الخلايا باستخدام قناة DAPI مع الإثارة عند 357 و44 نانومتر.

تحديد العدلات خارج الخلية elastase وcitrullinated هيستون H3 على قنوات البروتين الفلورسنت الأحمر والأخضر في تكساس على التوالي. الحفاظ على وقت التعرض المستمر والمكاسب لكل قناة طوال فترة اقتناء الصور لتجنب التشبع في كثافة البكسل. يتم تحديد الفخاخ العدلية خارج الخلية المستندة إلى التعريب المشترك من العدلات elastase، سيترولين هيستون H3 والحمض النووي خالية من الخلايا.

باستخدام الهيماتوكسيلين وossin وصمة عار، والمجهر brightfield، الخثار الشرياني القطط تتكون من خلايا الدم الحمراء، الكريات البيض، الفيبرين والصفائح الدموية. ظهرت NETs كشبكات من الخيوط الأرجوانية العميقة من أطوال مختلفة المحيطة الكريات الحمراء القريبة وككرة البيض. باستخدام هذا البروتوكول، كشف المجهر المناعي مجاميع كبيرة من NETs تتكون من الحمض النووي خالية من الخلايا، وcitrullinated هيستون H3 والعدلات elastase.

في ظل الطور التباين في المجهر المناعي ، تم وصف خثرة كهيكل جيد ترسيم داخل مساحة الأوعية الدموية. ومع ذلك، لم يتم اكتشاف الخثرة في أي من عينات التحكم. يوضح هذا الرقم الفلورة الذاتية العميقة لعناصر الجلطة مثل كريات الدم الحمراء عندما يتم تصويرها في الطول الموجي 488 نانومتر.

وإخماد الفلورة التلقائية الموجزة بعد وضع العلامات المناعية زادت بشكل كبير من حساسية البروتين المشترك في التعريب واكتشاف NET حتى في المناطق التي بها وفرة من كريات الدم الحمراء. مدة التثبيت آثار مناعية مستضدات معينة. نوصي التثبيت لمدة لا تزيد عن 24 ساعة على قدم المساواة الجفاف والبارافين تضمين.

بدلا من ذلك، يمكن استخدام شبهفورمالدهيد خالية من الميثانول للحد من القطع الأثرية عن طريق حمض الفورميك والكيتونات من أكسدة الفورمالديهايد. لمنع التداخل عند استخدام الأجسام المضادة الأولية التي تنشأ من نفس النوع ، قمنا بتضمين خطوة حظر إضافية لتشبع أي مواقع ملزمة متبقية على الأجسام المضادة الثانوية. يجب أن يتضمن المحققون ضوابط سلبية تتكون من الأجسام المضادة للأيزوبت، واستبعاد الأجسام المضادة الأولية وخطوة وضع العلامات المناعية والضوابط البيولوجية من القطط دون تجلط.

يمكن أن autofluoresence من حدود الأنسجة من الجلطات مطرقة تحديد المجهرية من الفخاخ خارج الخلية العدلات. يمكن للمحقق تقليل الفلورسينس باستخدام الفلوروفوروورات الحمراء البعيدة. يمكن أن تكون هذه التقنية أداة قيمة لدراسة الفخاخ العدلات خارج الخلية في الأنواع البيطرية الأخرى.

وهذا يمكن أن يوفر فهما أفضل للفيزياء المرضية من تجلط الدم.