تحفيز منافذ الخلايا الجذعية وتجديد الأنسجة في جلد الفأر عن طريق التوليد الضوئي المعتمد على البروتوبورفيرين التاسع لأنواع الأكسجين التفاعلية في الموقع

منهجيتنا هي الأولى التي توفر أداة تجريبية موثوقة للحث على تنشيط عابر لأنواع الأكسجين التفاعلي الذاتية أو إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي في الأنسجة في الجسم الحي. توفر منهجيتنا إجراء قويا وسهل الاستخدام وغير جراحي ينتج عنه إنتاج ثابت لمستويات ROS المحفزة الفسيولوجية في الجلد باستخدام مصدر الضوء الأحمر بشكل أساسي. نظرا لأن الحث الفسيولوجي ل ROS في الجلد يحقق احتياجات جذع الأنسجة ، فقد طبقنا منهجيتنا لعلاج تجديد الجلد بما في ذلك الشفاء الجيد ونمو الشعر.

تعد بيولوجيا وإشارات ROS حاليا نقطة ساخنة للأبحاث. يتمثل أحد القيود الرئيسية التي تحول دون التحقيق في وظيفة ROS في الجسم الحي في الافتقار إلى الأدوات الكافية للحث على إنتاج ROS داخلي متحكم فيه. منهجيتنا سهلة الاستخدام وسهلة ، ولكن جميع الأجهزة ، المصباح ، IV ، IS ، وما إلى ذلك ، تحتاج إلى معايرة بشكل مناسب.

يجب أن تكون السلائف الكيميائية الحرجة طازجة ويجب اتباع جميع الخطوات أو البروتوكول بدقة. للحث على نمو الشعر على الجلد الظهري للفئران في المرحلة الثانية من التيلوجين ، بعد التأكد من عدم الاستجابة لانعكاس الدواسة في حوالي اليوم 50 بعد الولادة C57 Black Six Messe ، استخدم ماكينة حلاقة وكريم مزيل الشعر لإزالة منطقتين مستقلتين جنبا إلى جنب من الجلد من الجزء الخلفي من كل فأر. بعد بضع دقائق ، قم بإزالة الكريم باستخدام PBS وسجل نمو بصيلات الشعر من خلال الحصول على صور عالية الدقة يوميا لمناطق الجلد الظهرية المراقبة والمعالجة لكل.

للحث على توليد آفات حروق من الدرجة الثانية على الجلد الظهري للفئران في المرحلة التيلوجين الثانية ، قم بإزالة الشعر من الجزء الخلفي من الفأر. سخن قضيب نحاسي مقطع عرضي بطول سنتيمتر واحد إلى 95 درجة مئوية في الماء المغلي وقم بتطبيق الشريط على المنطقة الوسطى من جلد الفأر لمدة خمس ثوان. مباشرة بعد توليد الحرق ، قم بحقن داخل الصفاق بملليلتر واحد من المحلول الفسيولوجي لمنع الجفاف والسماح للفئران بالتعافي لمدة 24 ساعة قبل الشروع في العلاج.

لتوليد خلايا الاحتفاظ المسماة BrdU أو LRCs ، قم بحقن زملاء القمامة البالغين من العمر 10 أو 14 يوما داخل الصفاق مرة واحدة يوميا لمدة أربعة أيام متتالية مع 50 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم من BrdU في PBS. بعد مرحلة وضع العلامات ، اسمح للفئران بالتطور لمدة 50 إلى 60 يوما قبل تطبيق العلاج. للحث على الإنتاج العابر لأنواع الأكسجين التفاعلية غير المميتة أو مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في جلد الفأر لتحليل نمو الشعر ، بعد الحصول على صورة نمو الشعر الأساسية ، ضع ما يقرب من 25 ملليغرام من كريم mALA موضعيا على منطقة الجلد المحلوقة اليمنى وضع في الظلام لمدة 2.5 ساعة.

في نهاية فترة العلاج بالحساسية الضوئية ، قم بإزالة أي كريم زائد مع PBS جيدا وتأكد من إنتاج PP9 في الموقع عن طريق التعبير الفلوري الأحمر تحت إثارة الضوء الأزرق ، ثم قم بإشعاع الجلد الخلفي بالكامل بمصدر ضوء أحمر مناسب لجرعة إجمالية تتراوح من 2.5 إلى 4 جول لكل سنتيمتر مربع. ثم اسمح للفئران بالتعافي على بطانية كهربائية مع المراقبة حتى الاستلقاء الكامل قبل إعادة إلى أقفاصها. لتشغيل إنتاج ROS العابر للشفاء من الحروق من الدرجة الثانية ، ضع ما يقرب من 25 ملليغرام من كريم mALA على طول سطح الحرق الأيمن وحوالي أربعة ملليمترات من الأنسجة المجاورة وضع في الظلام لمدة 2.5 ساعة كما هو موضح.

بعد إزالة الكريم ، قم بتشعيع جلد الظهر بالكامل واسمح للفئران بالتعافي مع المراقبة كما هو موضح. للحث على إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية العابر في جلد الذيل ، ضع ما يقرب من 25 ملليغرام من كريم mALA على طول منطقة الأنسجة الظهرية للفئران المعالجة BrdU وقم بإشعاع الجلد الظهري للذيل كما هو موضح. بعد القتل الرحيم للفئران ، احصد جلد الذيل للكشف عن BrdU.

استخدم مشرطا لحصاد الذيل من كل ، ثم قم بعمل شقوق طولية مستقيمة وقشر الجلد بالكامل كقطعة واحدة من العمود الفقري. احتضان قطع الجلد المقشرة في خمسة ملليمولار EDTA و PBS وخمسة أنابيب ملليلتر لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية للسماح بالفصل الدقيق لصفائح البشرة السليمة عن الأدمة باستخدام الملقط. قم بإصلاح الأنسجة المنفصلة في 4٪ فورمالديهايد و PBS لمدة 72 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتسمية الأنسجة الثابتة بالأجسام المضادة المترافقة الفلورية ذات الأهمية قبل تصور الأنسجة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر الفلوري وفقا للبروتوكولات القياسية لتحديد وتحديد LRCs في ظل كل حالة تجريبية. لتقييم خارج الجسم الحي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، بعد حصاد قطع جلد ذيل الفأر كما هو موضح ، احتضان الأنسجة الضابطة غير المعالجة وخمسة مللي مولار EDTA و PBS وحدها وعينات المعالجة الضوئية الديناميكية في EDTA مكملة باثنين من مليمولار mALA. بعد ذلك ، أضف الهيدروإيثيدين إلى تركيز نهائي 3.2 ميكرومولار لكل مجموعة من الأنسجة واحتضان جميع العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

في نهاية الحضانة ، استخدم أطراف الأصابع لتمديد عينات جلد الذيل على سطح زجاجي وتشعيع الأنسجة المعالجة ب 636 نانومتر من الضوء الأحمر بمعدل 10 جول لكل سنتيمتر مربع. في نهاية العلاج ، افصل البشرة على الفور عن الأدمة وقم بإصلاح صفائح البشرة في 4٪ فورمالديهايد و PBS لمدة 72 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. في نهاية التثبيت ، قم بتقييم انبعاث 2-hydroxyethidium الأحمر عن طريق المجهر الفلوري باستخدام الضوء الأخضر المثير للسماح بالحصول على صور عالية الجودة.

للكشف في الجسم الحي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الجلد الظهري ، بعد تشعيع الضوء الأحمر مباشرة ، ضع 100 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل مليلتر DH-FDA و 50٪ إيثانول على جميع مناطق الجلد المستهدفة والمعالجة. يؤدي الإعطاء الموضعي لسلائف mALA على ظهر الفأر وجلد الذيل إلى تراكم كبير للبروتوبورفيرين التاسع في الأنسجة بأكملها وبشكل ملحوظ في بصيلات الشعر كما يتضح من التألق الوردي المحمر لهذا المركب تحت إثارة الضوء الأزرق. يعزز التشعيع اللاحق للأنسجة المعالجة بالضوء الأحمر الإنتاج العابر ل ROS داخل الأنسجة خاصة في منطقة انتفاخ بصيلات الشعر.

يؤدي تشغيل إنتاج ROS غير المميت في جلد الفأر في الجسم الحي إلى زيادة كبيرة في عدد LRCs في منطقة انتفاخ بصيلات الشعر بعد يومين من العلاج الضوئي الديناميكي. والجدير بالذكر أن الزيادة في أعداد مصادر التعلم عابرة ، حيث تعود إلى المستويات الطبيعية بعد ستة أيام من العلاج. يعمل إنتاج ROS العابر على تسريع التئام الجلد بعد حروق من الدرجة الثانية.

القياس الكمي للتخفيض التدريجي للجلد التالف المتانة والأهمية الإحصائية لأنسجة عملية تسريع التئام الجروح. وبالمثل ، فإن مستويات ROS غير المميتة تعزز بقوة نمو الشعر بعد الحلاقة خلال التيلوجين المنسق الثاني ، وهي المرحلة التي تكون خلالها بصيلات الشعر مقاومة للاستجابة لمنبهات النمو. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا تقليل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بعد العلاجات الضوئية بشكل كبير من خلال استخدام المركبات المضادة للأكسدة.

يجب تأكيد إنتاج PP IX في الموقع عن طريق التعبير الفلوري الأحمر تحت إثارة الضوء الأزرق بعناية. للحث على إنتاج ROS ، يجب تحديد إشعاع مصدر الضوء الأحمر بشكل صحيح. مقابل الأنسجة والجرعة الخفيفة الإجمالية.

بعد تحريض ROS ، يمكن استخدام تقنيات البيولوجيا الكيميائية الحيوية والخلوية والجزيئية الحالية لتحليل العينات التي تم جمعها وتقييم الاستجابة الفسيولوجية الديناميكية للأنسجة. توفر منهجيتنا أداة قوية للتحقيق في التأثير الفسيولوجي للإنتاج العابر ل ROS الذاتي في الأنسجة في الجسم الحي. هذا نهج تجريبي جديد قد يكون مفيدا جدا للباحثين في مجال إشارات ROS.