نموذجان مختلفان لتفضيل المكان في الوقت الحقيقي باستخدام علم الوراثة البصرية داخل منطقة فينترال تيمنتال من الماوس
فبراير 12, 2020
هنا نقدم اثنين من سهلة لمتابعة خطوة بخطوة بروتوكولات لنماذج تفضيل مكان باستخدام optogenetics في الفئران. باستخدام هذه الاجهزة المختلفة ، والأفضلية وتجنب السلوكيات يمكن تقييمها بقوة داخل نفس الجهاز مع الانتقائية المكانية والزمنية العالية ، وبطريقة مباشرة.
نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لتقييم الخصائص المجزية أو الكارهة للتحفيز الوراثي لمنطقة معينة من الدماغ. يمكن لهذه التقنية الإجابة بسرعة إذا كان تحفيز خلايا معينة مجزية أو غير مجزية. نحن وصف الإعداد لتحفيز منطقة البطن tegmental ولكن يمكن بسهولة تكييف بروتوكولاتنا لتغيير معلمات محددة من حيث المناطق المختلفة التي تمت دراستها.
للبدء، استخدم أجهزة التحكم الدقيقة ذات اللوحة الواحدة للتحكم في مصدر الليزر. تحميل البرنامج النصي على متن متحكم دقيق باستخدام كابل الاتصال المناسب إلى الكمبيوتر. يتضمن البرنامج النصي التشكيل الخارجي القادمة من برنامج التتبع من خلال مربع TTL ، وإخراج الليزر للتحكم في معلمات التحفيز.
استخدم كبل شبكة اتصال لتوصيل مربع TTL باللوحة. تأكد من تعيين الليزر للتحكم عن طريق التشكيل الخارجي، وتوصيل الليزر باللوحة باستخدام كابل FC/PC. قم بتوصيل الدبابيس المناسبة إلى الأجزاء الأرضية من اللوحة.
لتوصيل مصدر الليزر بالألياف البصرية، قم أولاً بتوصيل مصدر الليزر بمفصل دوار. قم بتوصيل سلك التصحيح بالمفصل الدوار. تحقيق الاستقرار في المفصل الدوار فوق الجهاز، ولكن خارج منطقة التسجيل.
تأكد من طول الحبل التصحيح الألياف البصرية هو المناسب للسماح للماوس للتحرك دون صعوبات في الساحة. لمعايرة الإعداد الساحة، استخدم مسطرة لقياس جزء معين من الجهاز المادي. في البرنامج، رسم خط المقابلة للجزء الذي تم قياسه.
ضمن علامة التبويب رسم مقياس لمعايرة، أدخل القيمة المعروفة بالفعل. تصميم الساحة ، ورسم المنطقة التي سيتم تسجيل حركة الفئران. إنشاء المناطق، رسم المناطق التي سيتم تعيينها في نهاية المطاف كما الليزر-الاقتران، ليزر-غير م ولايريد، ومحايدة.
اضغط الزر التحقق من صحة الإعداد للتحقق من صحة الإعداد للتأكد من عدم وجود معلمات متعارضة، على سبيل المثال، مناطق خارج الساحة. تأكد من تمكين عنصر تحكم الأجهزة، ثم قم بتعيين وقت التجربة إلى 30 دقيقة، إلى خيار تكرار السمسم في إعدادات مربع المرجع. تعيين مقصورة كما الليزر-الاقتران، في إدخال الماوس الذي سيؤدي إشارة TTL من خلال تتبع البرمجيات إلى متن متحكم في الدقيقة تحت إعدادات الشرط.
لتعديل الإعداد لنهج تفضيل المقصورة المحايدة، بعد إعداد الساحة والوقت، قم بتعيين منطقتي A و B كـ laser-paired عن طريق إضافة نقطة الوسط في أي من المنطقة A والمنطقة B لمربع الشرط المرتبط بإعدادات مقصورتي A و B. لإعداد إعدادات الكشف عن استخدام دمية لتشبه الماوس. ضع الدمية في مقصورة واحدة من الجهاز، واستخدم الإعداد التلقائي مع الطرح الديناميكي.
إزالة دمية ووضعها في المقصورة المقابلة. تأكد من الكشف عن الدمية بشكل كامل. ضع الدمية في المقصورة التي إقرانها الليزر.
للتحقق مما إذا كان التحفيز يعمل، ابدأ في الحصول على استخدام إعدادات التحكم التجريبية التي تم تكوينها مسبقًا ومعرفة ما إذا كان التحفيز قد تم تشغيله كما يجب. ثم ضع الدمية في المقصورة غير المُجَدَّدة أو المحايدة، ونرى ما إذا كان التحفيز قد توقف أم لا. استخدم مقبض الباب على الليزر لتعيين قوة الليزر إلى 10 مللي واط.
قم بتوصيل غرسة الألياف البصرية بحبل الألياف البصرية باستخدام كم من السيراميك، ووضع الماوس في المقصورة المحايدة للجهاز الثلاثي المقصورة. انتظر حتى يتم الكشف عن الماوس من قبل البرنامج. إزالة أبواب انزلاق عمودي تقييد الحيوان من دخول المقصورات الرئيسية.
السماح للحيوان لاستكشاف بحرية دون أي إزعاج. كامل تجربة تفضيل المكان في الوقت الحقيقي تجري طوال ثماني جلسات. تم اختبار الفئران DAT-Cre حقنها مع فيروس AAV channelrhodopsin EYFP في منطقة تيغمنتال البطني لاستهداف الخلايا العصبية الدوبامين.
قضى الفئران في المتوسط حوالي 70٪ من وقتهم في المقصورة بالليزر المقترنة، بدلا من المقصورة غير المدفوعة في 20٪، والمقصورة المحايدة في 10٪ لوحظ نمط ظاهري سلوكي معاكس مع الفئران Vglut2-Cre حقنها مع AAV channelrhodopsin EYFP في منطقة تيغمنتال البطنية. تجنبت الفئران المقصورة مقترنة بالتحفيز ، وأمضت المزيد من الوقت في الـ"غير مُؤمّن". خلال أيام الردود المشروطة خمسة وثمانية أيام، لم تظهر الفئران تجنب واضح للحجرة التي تم إقرانها سابقًا.
لمزيد من إثبات دور مجزية أو aversive من خلايا عصبية معينة، يمكن أن تكمل الأسلوب الموصوفة مع أساليب أخرى مثل نماذج أوبرون، أو التحفيز الفرعية الضوئية. انتبه أثناء التعامل مع الفيروسات وعند استخدام مصادر الليزر.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولين لنماذج تفضيل المكان باستخدام علم البصريات الوراثي في الفئران، مما يسمح بتقييم سلوكيات التفضيل والتجنب بانتقائية مكانية وزمنية عالية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التحليل السلوكي
- علم البصريات الوراثي
خلفية علمية
- يُعد فهم الخصائص المُجزية والمنفرة لتحفيز الدماغ أمراً بالغ الأهمية في علم الأعصاب.
- تتيح التقنيات البصرية الوراثية (Optogenetics) تحكماً دقيقاً في النشاط العصبي.
- تُستخدم نماذج تفضيل المكان بشكل شائع لتقييم الاستجابات السلوكية للمنبهات.
- تركز هذه الدراسة على المنطقة السقفية البطنية (ventral tegmental area) ودورها في معالجة المكافأة.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكولات لتقييم آثار التحفيز البصري الوراثي على سلوك الفأر.
- تقييم كيفية تأثير تحفيز عصبونات محددة على التفضيل والتجنب.
- توفير إعداد مرن يمكن تكييفه ليتناسب مع مناطق مختلفة من الدماغ.
الطرق المستخدمة
- استخدام المتحكمات الدقيقة ذات اللوحة الواحدة للتحكم في التحفيز بالليزر.
- معايرة الساحة التجريبية لتتبع حركات الفأر بدقة.
- تنفيذ إشارات TTL لمزامنة التحفيز مع سلوك الفأر.
- تقييم الاستجابات السلوكية عبر جلسات متعددة مع أنماط جينية مختلفة للفئران.
النتائج الرئيسية
- أظهرت فئران DAT-Cre تفضيلاً للمقصورة المقترنة بالليزر، حيث قضت 70% من وقتها هناك.
- أظهرت فئران Vglut2-Cre تجنباً للمقصورة المقترنة بالليزر.
- تباينت الاستجابات السلوكية عبر أيام الاختبار المختلفة.
- يمكن استكمال هذه الطريقة بتقنيات أخرى لإجراء مزيد من التحقق.
الاستنتاجات
- توفر البروتوكولات طريقة موثوقة لدراسة تأثيرات تحفيز عصبي محدد على السلوك.
- تشير النتائج إلى أنماط ظاهرية سلوكية متميزة بناءً على الخلفية الجينية.
- يمكن للأبحاث المستقبلية التوسع في هذه النتائج باستخدام منهجيات إضافية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعد تقييم الخصائص المكافئة أو المنفرة للتحفيز العصبي أمراً بالغ الأهمية للتحقق من الأهداف في عملية اكتشاف الأدوية القائمة على علوم الأعصاب. وتتيح نماذج التفضيل المكاني في الوقت الفعلي استجواباً سريعاً وسببياً لدوائر عصبية محددة، مما يدعم تقليل المخاطر الآلية للفرضيات العلاجية. ويوفر هذا النهج قراءات سلوكية كمية تساهم في اتخاذ قرارات الاستمرار أو التوقف في تدفقات عمل الاكتشاف المبكر.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح الاختبار السببي لما إذا كان تحفيز مجموعة عصبية محددة يؤدي إلى ظهور أنماط سلوكية مرتبطة بالمكافأة أو النفور.
- القيمة التشغيلية: توفر قراءات سلوكية كمية في الوقت الفعلي وبدقة زمنية عالية لدعم استقصاء الفرضيات.
- القيمة التنبؤية: تدعم الثقة في الهدف من خلال ربط التنشيط العصبي بمخرجات سلوكية قابلة للقياس وذات صلة بالدواعي العصبية والنفسية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تؤسس هذه الطريقة مقايسة سلوكية معيارية وقابلة للتكرار لفحص أهداف التعديل العصبي باستخدام التحفيز البصري الوراثي.
- المخرجات الكمية: تولد مقاييس الزمن المستغرق في كل قسم، والتي تعمل كمتغيرات تابعة لتقييم تأثيرات التحفيز عبر الأنماط الجينية أو الظروف المختلفة.
- القابلية للتوسع: يمكن تكييف البروتوكول مع مناطق مختلفة من الدماغ ومعاملات تحفيز متنوعة، مما يسمح بإجراء حملات فحص تشمل أهدافًا متعددة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: تحاكي عملية تحفيز المنطقة السقفية البطنية وظيفة المسار الميزوليمبي، وهو ما يرتبط بالاضطرابات المتعلقة بالمكافأة وعلاجات الإدمان.
- الاستمرارية الترجمية: تعمل القراءات السلوكية في الوقت الفعلي كجسر يربط بين دراسات التعديل العصبي الحاد وتقييمات تفضيل المكان الشرطية طويلة المدى.
- تقليل المخاطر الآلية: تساعد في التمييز بين التأثيرات العصبية المباشرة والاستجابات التعويضية للشبكة، مما يقلل من الغموض في آلية الاستهداف.
تكامل تدفق العمل والمسارات التحليلية
تندرج هذه الطريقة ضمن مرحلة بيولوجيا الاكتشاف، حيث يسبق التحقق من صحة الأهداف على مستوى الدائرة عملية تحديد المركبات الرائدة واختبارات الفعالية قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال تحديد ما إذا كان التنشيط البصري الوراثي لعصبونات محددة يحفز سلوكيات المكافأة أو النفور.
- الفحص: تتيح توحيد المقاييس وقابلية تكرار الاختبارات لتقييم أهداف التعديل العصبي عبر ظروف جينية أو فارماكولوجية مختلفة.
- التحليلات: توفر متغيرات تابعة كمية (الوقت الذي يقضيه الحيوان في المقصورات المقترنة بالليزر، أو غير المقترنة، أو المحايدة) للمقارنة الإحصائية لآثار التحفيز.
- البحث الانتقالي: تربط آثار التحفيز العصبي الحاد بالأنماط الظاهرية السلوكية ذات الصلة بالنماذج قبل السريرية لمعالجة المكافأة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يمكن توحيد إطار العمل عبر المختبرات وتكييفه مع مناطق دماغية مختلفة، مما يعزز إعادة الاستخدام على مستوى المنصة في اكتشافات علوم الأعصاب.
الأثر التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقدم رؤية ميكانيكية حول السببية العصبية، مما يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة في اختيار الأهداف.
- القيمة التشغيلية: يتيح تقييمًا سلوكيًا عالي الإنتاجية باستخدام التتبع الآلي والتحكم في التحفيز في الوقت الفعلي.
- القيمة الاستراتيجية: يعزز الثقة في استراتيجيات تعديل الأهداف، مما يدعم تخصيصًا أفضل للموارد في مراحل الاكتشاف المبكرة.
- التأثير على المحفظة: يسهل تحديد أولويات الأهداف بناءً على المخاطر المعدلة، استنادًا إلى التحقق السلوكي من التأثيرات المحددة للدوائر العصبية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم البصريات الوراثي (optogenetics)، وإيصال النواقل الفيروسية، والجراحة التجسيمية (stereotaxic surgery) لاستهداف الخلايا العصبية بدقة.
- يعتمد على أجهزة متكاملة تشمل المتحكمات الدقيقة، وأجهزة الليزر، والوصلات الدوارة، والألياف الضوئية، وبرمجيات تتبع السلوك.
- يستلزم توحيد المعايير بين فرق علوم الأعصاب والهندسة ومجموعات تحليل البيانات لضمان اتساق الإعداد والمعايرة.
- يجب مراعاة التباين في تعبير الأوبسين (opsin)، وموضع الألياف، وتوصيل قدرة الليزر عبر العينات.
- يقتصر على التأثيرات السلوكية الحادة؛ ولا يقيم التكيف المزمن أو الآليات التعويضية دون إجراء دراسات طولية تكميلية.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية البيولوجية
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Setting up the Control of the Laser Source
1:44
Setting Up the Experiment for the RT-PP (Real-Time Place Preference) Approach and NCP (Neutral Compartment Preference) Approach
3:13
Performing an Experiment Using Laser Stimulation
4:24
Results: Real-Time Place Preference Experiment
5:18
Conclusion
