بسيطة خالية من الطباعة الحجرية خلية واحدة Micropatterning باستخدام الليزر قطع الإستنسل
أبريل 3, 2020
يقدم هذا البروتوكول طريقة micropatterning خالية من الطباعة الحجرية بسيطة ومتاحة لأولئك الذين يتمتعون بخلفية محدودة في الهندسة الحيوية. تستخدم هذه الطريقة الإستنسل اتّقص بالليزر حسب الطلب لبروتينات مصفوفة خارج الخلية في شكل اهتمام بتحوير الخلايا المورفولوجيا. يتم إثبات إجراء micropatterning باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من خلايا القلب.
سنصف طريقة ميكروباتترن أحادية الخلايا الخالية من الخلايا الأحادية القائمة على الاستنسل، تتغلب على العديد من العقبات المرتبطة بالطباعة الحجرية الضوئية والطباعة الحجرية الناعمة. الاستنسل قابلة لإعادة الاستخدام والعملية غير مكلفة وقابلة للتخصيص. فتحت هذه الطريقة وسيلة جديدة للباحثين غير المهندسين لدراسة شكل الخلايا وchanotransduction الناجمة عن المنطقة في سياقات مختلفة الفسيولوجية والمرضية.
وعلاوة على ذلك، يسمح هذا البروتوكول لmicropatterning من الآلاف من الخلايا التي يمكن استخدامها لفحص المخدرات عالية الإنتاجية والنمذجة المرض في طبق. سوف مظاهرة البصرية تسهيل زرع خطوتين حاسمة: مفرزة من الأغطية من هيدروجيل، وتجفيف الهيدروجيل بما فيه الكفاية قبل وضع الاستنسل. إعداد حل البولي أكريلاميد هيدروجيل في أنبوب جديد من أجهزة الطرد المركزي من البروبيلين 50 ملليلتر كما هو موضح في المخطوطة.
بعد ذلك ، لإعداد محلول 5٪ من الضوئيات ، قم بحل المكونات في 700 ميكرولترات من الإيثانول بنسبة 100٪. المكونات ليست قابلة للذوبان في الماء لذا تأكد من أن تذوب تماما من قبل دوامة. إضافة 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لحجم النهائي من ملليلتر واحد.
العمل على الجليد، وتمييع الطابق السفلي غشاء مصفوفة البروتين الأسهم حل مع الجليد بارد DMEM F12 وسائل الإعلام أو 1X PBS إلى نسبة التخفيف الأمثل. الحفاظ على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق. عند العمل مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي، تأكد من العمل دائما على الجليد واستخدام حلول الجليد الباردة في النصائح والميصة المبردة وأنابيب.
ضع مصباح بدلاء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة السلامة البيولوجية. المقبل، ضع الأفلام البارافين تعقيم أعدت سابقا. إذا كانت أفلام البارافين ليست جافة تماما، استخدم نظام التطلع فراغ لإزالة أي السائل المتبقية.
باستخدام ملقط autoclaved، ضع ستة يغطي autoclaved على فيلم البارافين ستة في كل طبق بيتري. لإعداد حل البولي أكريلاميد للأشعة فوق البنفسجية القابلة للربط، تمييع محلول الضوئي مع حل السلائف الهيدروجيل البوليكريلاميد. تعقيم الحل باستخدام وحدة تصفية 50 ملليلتر مع حجم مسام ميكرومتر 0.22.
ثم الاستغناء 200 ميكرولترات من الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط بوليكريلاميد الحل النهائي على كل من يغطي الزجاج الستة في أطباق بيتري. باستخدام ملقط ذاتية التكفا، قم بتغطية كل غطاء بعناية مع غطاء ثاني ينبس طبقة من الحل بين الأغطية. ضع أطباق بيتري التي تحتوي على الأغطية تحت مصباح مقاعد البدلاء للأشعة فوق البنفسجية مع الغطاء غير المغلق.
تغطية ورقة بيضاء على سطح غير أبيض مهم للحد من فقدان كثافة الأشعة فوق البنفسجية. للحماية من الأشعة فوق البنفسجية، غطي المصباح بورق الألومنيوم. Photopolymerize الهيدروجيلات البولي اكريلاميد لمدة خمس دقائق.
استخدم شفرة حلاقة لفصل كل زوج من الأغطية بعناية. ملء الخزان الذي يحتوي على ستة مركبات غطاء هيدروجيل مع برنامج تلفزيوني. بعد الشطف لمدة خمس دقائق، والعودة المركبة غطاء هيدروجيل إلى فيلم البارافين في طبق بيتري.
الحصول على أنبوب من Sulfo-SANPAH من التخزين في ناقص 80 درجة مئوية. إضافة 1، 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مبردة مسبقا إلى الأنبوب ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. الاستغناء عن 200 ميكرولترات من Sulfo-SANPAH المخفف على فيلم البارافين في طبق بيتري.
وضع مركب غطاء هيدروجيل على Sulfo-SANPAH مع الهيدروجيل الاتصال Sulfo-SANPAH. بعد ذلك ، ضع مركبات غطاء هيدروجيل تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية وفضحها لمدة خمس دقائق لتنشيط Sulfo-SANPAH. إذا تحول Sulfo-SANPAH من البرتقالي إلى البني مما يشير إلى نجاح التنشيط والدمج ، انتقل إلى الخطوات التالية في غضون 10 دقائق.
تجديد خزان البولي بروبلين المتاح مع برنامج تلفزيوني جديد. نقل مركبات غطاء هيدروجيل المنشط إلى الخزان وشطفها لفترة وجيزة لإزالة Sulfo-SANPAH غير منضم. ضع مركبات غطاء الهيدروجيل على فيلم البارافين في أطباق بيتري وامسحها بعناية مع مناديل خالية من الوبر العقيمة.
وضع استنسل على رأس كل مركب غطاء هيدروجيل. لضمان ختم محكم بين الاستنسل والمركبة، قم بإزالة الرطوبة الزائدة عن طريق الزبن مع مناديل خالية من الوبر. الاستغناء بعناية عن غشاء الطابق السفلي المخفف مصفوفة حل البروتين وضع 200 ميكرولتر على رأس كل مركب غطاء هيدروجيل.
احتضان الانشاءات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، نقل المركبات إلى لوحة ستة جيدا. يمكن التحقق من صحة الختم الضيق بين الهيدروجيل والاستنسل بسهولة من خلال ملاحظة ما إذا كان قد تم الاحتفاظ بمحلول بروتين المصفوفة على قمة الاستنسل.
الفشل في تشكيل ختم ضيق يؤدي إلى تسرب سريع من محلول البروتين من خلال الثقوب. غمر تماما المركبات في برنامج تلفزيوني. باستخدام ملاقط autoclaved، فصل بعناية الاستنسل من الهيدروجيلس دون تمزيق الهيدروجيل.
إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار وإعادة ملء الآبار مع DMEM. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. بعد إزالة لوحة من الحاضنة، فحص DMEM.
إذا DMEM غير غائم، وhydlip مركبات هيدروجيل جاهزة للاستخدام في طلاء الخلايا. كانت قوالب الاستنسل ملفقة تحتوي على صفائف من المربعات والمستطيلات. تم إنشاء ركائز هيدروجيل micropatterned من الاستنسل وتم الحصول على جزر من البروتين المصفوفة.
كما تم الحصول على جزر الخلية. على سبيل المثال، جزر من الخلايا القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية التي يسببها الإنسان. ماتريكس تركيز البروتين لعبت دورا أساسيا في توليد أنماط السليم.
أدى التركيز الأمثل إلى توزيع متجانس للبروتينات. أدت تركيزات محلول البروتين المصفوفة دون الأمثل إلى نقش دون المستوى الأمثل. من الضروري استخدام الجانب الأمامي من الاستنسل.
إذا تم استخدام الجانب الخلفي من الاستنسل ، فإن حجم الجزر البروتينية المصفوفة يزيد بسبب اتجاه القطع بالليزر. أثناء استخدام الجانب الخلفي من الاستنسل لم يؤثر بشكل كبير على عرض النقوش المستطيلة، زاد الارتفاع بشكل كبير مما أدى إلى انخفاض في نسبة العرض إلى الارتفاع المقصودة. تم تطبيق النقش القائم على الاستنسيل على ركائز ميسترومر السيليكون.
تم تصور الخلايا القلبية المنقوشة على ركائز ميسترومر السيليكون من خلال الكيمياء المناعية للتروبونات القلبية T في التكبير المنخفض وعن طريق البروتين الساركميري ألفا أكتينين في التكبير العالي. تم تطبيق النقش القائم على الاستنسل أيضًا على نمط اثنين من الخلايا القلبية جنباً إلى جنب على الهيدروجيل مع تصلبات مختلفة. وقد جعل اكتشاف الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وبروتوكولات التمايز المقابلة لها نموذجًا بشريًا مثاليًا في المختبر لدراسة تولد النسل والأمراض.
ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية لاستخدام نظام IPS هو عدم وجود هيكل للبيئة الدقيقة التي لديها تركيبة كيميائية حيوية معينة وتصلب للتفاعل مع الخلايا. ويمكن الجمع بين النقش مع المجهر قوة الجر والجر المقايسات المناعيةchemistry لتوصيف هيكل ووظيفة عضلة القلب. تحليل أنواع الخلايا المشتقة من IPS ، في حالاتنا cardiomyocyte ، في مورفولوجيا أكثر فسيولوجية يفتح الفرص لدراسة cardiomyocytes الصعبة في طبق الثقافة.
ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على العديد من النظم الأخرى مثل ولوحات فحص المحتوى العالي. يمكن ضبط الشكل والركيزة بسهولة إلى التطبيق.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول طريقة لتشكيل الأنماط الدقيقة القائمة على القوالب والمستغنية عن الليثوغرافيا، وهي طريقة متاحة للباحثين ذوي الخبرة المحدودة في الهندسة الحيوية. تعتمد هذه الطريقة على استخدام قوالب قابلة لإعادة الاستخدام ومقطوعة بالليزر لتشكيل أنماط دقيقة من بروتينات المصفوفة خارج الخلوية، مما يتيح تعديل مورفولوجيا الخلايا، لا سيما في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة وافرة القدرة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- الهندسة الحيوية
- أبحاث الخلايا الجذعية
خلفية علمية
- يمكن أن تكون طرق التصوير الضوئي التقليدية والطباعة الحجرية اللينة معقدة ومكلفة.
- صُممت هذه الطريقة الجديدة لتكون غير مكلفة وقابلة للتخصيص.
- وهي تتيح للباحثين من غير المتخصصين في الهندسة استكشاف شكل الخلية ونقل الإشارات الميكانيكية.
- يمكن تطبيق التشكيل الدقيق على آلاف الخلايا للتطبيقات ذات الإنتاجية العالية.
الغرض من الدراسة
- توفير طريقة بسيطة لتشكيل الأنماط الدقيقة (micropatterning) تكون متاحة لنطاق أوسع من الباحثين.
- تسهيل الدراسات المتعلقة بمورفولوجيا الخلايا ونقل الإشارات الميكانيكية (mechanotransduction) في سياقات متنوعة.
- تمكين الفحص عالي الإنتاجية للأدوية ونمذجة الأمراض.
الطرق المستخدمة
- تحضير محلول هيدروجيل البولي أكريلاميد.
- استخدام قوالب مقصوصة بالليزر للتنميط الدقيق.
- فصل الغطاء الزجاجي عن الهيدروجيل.
- تجفيف الهيدروجيل قبل وضع القالب.
النتائج الرئيسية
- تنجح هذه الطريقة في تشكيل أنماط من بروتينات المصفوفة خارج الخلوية.
- تُظهر الطريقة القدرة على تعديل مورفولوجيا الخلايا بشكل فعال.
- تُعد تطبيقات الإنتاجية العالية مجدية باستخدام هذا النهج.
- تعزز العروض المرئية من فهم البروتوكول.
الاستنتاجات
- تبسط هذه الطريقة الخالية من الطباعة الحجرية عملية التشكيل الدقيق.
- تفتح هذه الطريقة آفاقاً جديدة للبحث في بيولوجيا الخلية ونقل الإشارات الميكانيكية.
- يعد هذا البروتوكول مناسباً لمجموعة واسعة من التطبيقات في الأبحاث الطبية الحيوية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تعالج طريقة التنميط الدقيق القائمة على القوالب والخالية من الليثوغرافيا عوائق إمكانية الوصول في تحليل الخلية الواحدة، مما يمكن فرق البحث والتطوير على نطاق أوسع من دراسة نقل الإشارات الميكانيكية وتحديد مصير الخلية دون الحاجة إلى خبرة متخصصة في التصنيع الدقيق. ومن خلال دعم التنميط عالي الإنتاجية لآلاف الخلايا، تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في سير عمل التحقق من الأهداف والفرز المظهري. كما يقلل هذا النهج من التعقيد التقني والتكلفة، مما يسهل الاعتماد القابل للتوسع في مراحل الاكتشاف المبكرة وتطوير النماذج قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصناعات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تعديل شكل الخلية وحجمها لدراسة مسارات نقل الإشارات الميكانيكية في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض.
- القيمة التشغيلية: توفر منصة قوية ومنخفضة التكلفة للتحقق الوظيفي من الأهداف باستخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC وأنواع الخلايا الأخرى.
- الثقة التنبؤية: تدعم فرز محفظة المشاريع من خلال توليد قراءات مورفولوجية ووظيفية كمية تقلل من المخاطر المرتبطة بالافتراضات الميكانيكية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية معتمدة لتقييم المركبات لاحقاً من خلال إنشاء ركائز ذات أنماط دقيقة ومعيارية مع التحكم في عرض المصفوفة خارج الخلوية.
- القيمة التشغيلية: تمكين توحيد المقايسات وقابليتها للتكرار من خلال استخدام قوالب مفرغة ومقطوعة بالليزر قابلة لإعادة الاستخدام، وعمليات نمطية متسقة للبروتينات القائمة على الهيدروجيل.
- القابلية للتوسع: دعم الجاهزية للفحص عالي الإنتاجية من خلال نمذجة مصفوفات تصل إلى 2,000 خلية لكل تجربة، مما يسهل دراسة الاستجابة للجرعة والتوصيف المظهري.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- النظام ذو الصلة بالمرض: ينطبق على الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC، مما يسمح بدراسة المورفولوجيا المستطيلة الشبيهة بالخلايا البالغة التي توفر نموذجاً أفضل للنقل الميكانيكي الفسيولوجي في سياقات أمراض القلب.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين مرحلة الاكتشاف والعمل ما قبل السريري من خلال السماح بتقييم بنية الخلية ووظيفتها عبر مستويات مختلفة من صلابة الركيزة، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية والتقدم المعدل وفقاً للمخاطر.
- تقليل مخاطر الآليات: يقلل من الغموض في العلاقات بين النمط الظاهري والنمط الجيني من خلال عزل تأثير هندسة الخلية على مسارات التأشير، مما يحسن القيمة التنبؤية للانتقال إلى الدراسات الحية in vivo.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار الفرضيات وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يوفر تحضيراً معيارياً للخلايا من أجل المقايسات الميكانيكية والنمط الظاهري.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تمكين التحكم الدقيق في شكل الخلية ومساحتها لدراسة تحويل الإشارات الميكانيكية في النماذج المشتقة من iPSC.
- الفحص: توفر جاهزية المقايسة والمخرجات الكمية عبر نمذجة دقيقة قابلة للتكرار لآلاف الخلايا، مما يتيح فحص المركبات بشكل موثوق في تطبيقات نمذجة الأمراض.
- التحليلات: تولد مخرجات قابلة للقياس مثل محاذاة الخلايا، وتكوين جزر البروتين، والمقاييس المورفولوجية التي تساعد الفرق على مقارنة الظروف عبر الاضطرابات الجينية أو الفارماكولوجية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الاستمرارية قبل السريرية من خلال السماح بالنمذجة على ركائز قابلة للضبط (مثل silicon elastomer) لتقييم الاستجابات المعتمدة على الصلابة، وهو أمر ذو صلة بنماذج القلب التليفية أو الإقفارية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تضع نهج القوالب كقدرة قابلة لإعادة الاستخدام عبر المشاريع، مما يقلل من إعدادات التكرار ويمكّن الاعتماد المتبادل بين الفرق في منصات البيولوجيا الميكانيكية والفحص المظهري.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق تقليل الغموض الآلي من خلال التنميط الدقيق الخاضع للتحكم للخلايا المفردة.
- القيمة التشغيلية: تعزز التقييس وقابلية التكرار والقابلية للتوسع من خلال استخدام قوالب قابلة لإعادة الاستخدام وتنميط قائم على الهيدروجيل يتوافق مع سير عمل زراعة الخلايا القياسي.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين الكشف المبكر عن الاستجابات المظهرية المعتمدة على الشكل، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من البرامج التي تركز على القلب والأوعية الدموية والتحويل الميكانيكي.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال توليد بيانات عالية المحتوى ومرتبطة بالشكل الظاهري، مما يساهم في اختيار الأهداف وتحسين المركبات الرائدة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة أساسية في زراعة الخلايا والبيولوجيا الجزيئية؛ ولا حاجة إلى تدريب متخصص في التصنيع الدقيق.
- يعتمد على توفر مصدر للضوء فوق البنفسجي (UV)، وتصنيع القوالب المقطوعة بالليزر (يمكن إسنادها لجهة خارجية)، وكواشف الهيدروجيل القياسية (مثل acrylamide وSulfo-SANPAH).
- يستلزم توحيد معايير توجيه القوالب وتحضير الهيدروجيل بين الفرق لضمان اتساق نمط البروتين والتحكم في نسبة العرض إلى الارتفاع.
- تشمل اعتبارات المواءمة توافق الركيزة (مثل الزجاج أو المطاطات) وتحسين بروتين المصفوفة خارج الخلية لأنواع محددة من الخلايا.
- تشمل القيود العملية الحاجة إلى التعامل بعناية مع القوالب لتجنب تمزق الهيدروجيل، والتوقيت الدقيق أثناء تنشيط Sulfo-SANPAH لضمان تثبيت البروتين بكفاءة.
