توصيف البروتينات الخلوية مع الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات

في الخلية FPOP إلى جانب القياس الطيفي الشامل هو تقنية جديدة قوية تستخدم لدراسة التفاعلات البروتين البروتيني والبروتين التغيرات الهيكلية في الخلايا الحية. مع FPOP في الخلية، لا تحتاج إلى عزل البروتينات من الفائدة، ولكن يمكن بدلا من ذلك دراستها في بيئاتها الأصلية. وهذا مفيد بشكل خاص للبروتينات الغشاء.

مع هذه الطريقة، يمكنك دراسة التغيرات في التفاعلات البروتينية والبنية في مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك السرطان والاضطرابات الوراثية، حتى تتمكن من فهم أفضل وتوصيف لهم. لبدء التجمع من نظام التدفق، واستخدام حجر الانقسام لقطع أنابيب السيليكا تنصهر إلى الأحجام المناسبة. بعد ذلك ، ضع ستة مغناطيس أسطواني صغير في حقنة واحدة سعة 500 ميكرولتر وملء الحقنة ، ومحاقن ثانية سعة 500 ميكرولتر ، ومحاقن خمس ملليلتر مع عازلة للدجم.

بعد إزالة الهواء، ووضع الحقن على مضخة الحقن وتشديد سدادة مضخة الحقن بحيث حقنة الخلية قد ما يقرب من 50 ميكرولترات اليسار عندما الأكشاك المحرك. باستخدام محول إغراء، وربط صمام يدوي لكل حقنة وتجميع أنابيب السيليكا كما هو موضح، مع التأكد من خيط الخلية بالإضافة إلى خط السيليكا بيروكسيد الهيدروجين من خلال الصليب وإدراجه مباشرة في خط السيليكا ID 450. عندما تم توصيل كل من أنابيب، وضع نظام تدفق بجانب الليزر واستخدام أخف لحرق الطلاء السيليكا بعيدا على أنابيب القطر الداخلي 450 ميكرومتر لجعل نافذة لتشعيع الليزر.

ضع مُنقل مغناطيسي فوق حقنة الخلية التي تحتوي على المغناطيسات الستة، وحدد مضخة الحقنة إلى 492.4 ميكرولتر في الدقيقة من أجل معدل تدفق نهائي قدره 1083.3 ميكرولترات في الدقيقة. تدفق المخزن المؤقت عبر النظام ثلاث مرات لمسح النظام، والتحقق من كل اتصال لأية تسربات. استخدام عدسة محدبة لتركيز ليزر excimer على أنابيب السيليكا.

لاختبار نافذة التشعيع، ضع قطعة صغيرة من الورق خلف أنابيب السيليكا واطفئ الليزر. ثم قم بقياس المنطقة المحترقة من التشعيع واستخدام نافذة التشعيع ومعدل التدفق لحساب التردد الليزري المطلوب للحصول على جزء استبعادي من الصفر. لجمع الخلايا لهذا الإجراء، وغسل الخلايا من 70 إلى 90٪ التقاء T175 ثقافة قارورة مع محلول مناسب من الملح الصف ثقافة الخلية.

إعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من العازلة لحساب وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. من الأهمية بمكان أن يتم حساب الخلايا للتأكد من أنها كافية لتحليل المصب ، ولكن ليس الكثير مما تسبب في تجميعها وسد نظام التدفق. ثم resuspend الخلايا في مرتين 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من تركيز العازلة اغرم و aliquot الخلايا في واحد 500 وحدة تخزين ميكرولتر لكل عينة.

بالنسبة لـ FPOP في الخلية ، املأ حقنتين من الخمسة ملليلتر بمخزنة أغماد جديدة ، والحقنة 500 ميكرولتر التي تحتوي على المغناطيس مع aliquot واحد من الخلايا ، والمحقنة النهائية 500 ميكرولتر مع بيروكسيد الهيدروجين 200 ملليمولر المعدة حديثًا. بدوره على المُنذر المغناطيسي والطفرة في 220 ميكرولترات من ثنائيثيل السلفوكسيد إلى aliquot واحد من Quench. بعد خلط لطيف، ضع إخماد وراء نظام التدفق لجمع العينات المشععة وتشغيل الليزر.

بعد سبع ثوان، قم بتشغيل نظام التدفق. بمجرد انتهاء العينة المتدفقة، إيقاف الليزر وخلط بلطف Quench مع العينة التي تم جمعها. بعد ذلك ، املأ جميع المحاقن الأربعة بمخزن مؤقت جديد واغسل الحاجز من خلال نظام التدفق.

بعد انتهاء النظام التنظيف، كرر الإجراء مع aliquot جديدة من الخلايا والحلول دون تشعيع مثل أي عنصر تحكم الليزر لحساب أكسدة الخلفية داخل الخلايا. في حين أن العينة التالية قيد التشغيل، الطرد المركزي العينة الأولى وإعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولترات من العازلة الخلية المناسبة. ثم، نقل العينة إلى أنبوب microcentrifuge لتجميد فلاش في النيتروجين السائل.

عندما تنتهي جميع العينات من التشغيل، تفكيك نظام التدفق والتخلص من أنابيب السيليكا المستخدمة. ثم، وتنظيف جميع الاتصالات الأخرى عن طريق sonication لمدة ساعة واحدة في 50٪ من الماء 50٪ الميثانول الحل. بعد عزل وهضم البروتينات من الخلية lysate وفقا للبروتوكولات القياسية، وتحليل lysate الخلية هضم وفقا لبروتوكولات LCMS جنبا إلى جنب القياسية لتوطين تعديل FPOP protium واسعة.

ثم، تحميل البيانات في برنامج تحليل البروتين المناسب وتحليل البيانات مقابل قاعدة بيانات البروتين ذات الصلة وانزيم هضم ذات الصلة. مرة واحدة يتم الانتهاء من الملفات البحث، وحساب مدى أكسدة FPOP على البروتين من الفائدة. يُظهر تصوير الفلوريسنس للصور المُكدسة YZ المتعمّدة فصلًا واضحًا لمخزن الاجمد عن حل الخلية أثناء تدفقه عبر نافذة التشعيع بالليزر.

يمكن إنشاء خرائط الحرارة متوسط ثلاثي الأبعاد من العازلة أو خلية مُحلة مُعدة للدماد لتوضيح الاختلاط الأدنى للحلول اثنين. استخدام نظام تدفق الخلايا واحد يزيد من عدد البروتينات المعدلة التأسد بنسبة 13 أضعاف. لتأكيد تعديل البروتينات ذات الأهمية داخل الخلايا السليمة ، يمكن إجراء التصوير المفلور بعد معالجة بيروكسيد الهيدروجين وتشعيعه.

باستخدام الطيف الكتلي جنبا إلى جنب، يمكن أن تكون هذه التعديلات موضعية كذلك إلى الأحماض الأمينية محددة على البروتين. التحول لوحظ في هذا الكروماتوغرافي الأيون المستخرج يترجم إلى التغيير في الماء المفلورة الناجم عن الميثيونين المؤسد في الببتيد المعدلة. مقارنة في الخلية المسمى actin من خلال البصمة في المختبر يكشف مستويات مماثلة من الأكسدة, مشيرا إلى أن actin لديه إمكانية الوصول المذيب مماثلة لكل من الخلايا وفي المختبر الدراسات.

وعلاوة على ذلك، المقارنة بين مدى الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة للبروتين من التعديلات الفائدة على إمكانية الوصول المذيبات، والمخلفات المسمى محسوبة من اثنين من هياكل الكريستال actin يوضح أن في الخلية أكسدة كيميائية ضوئية سريعة من البروتين الفائدة تحقيقات بكفاءة إمكانية الوصول إلى المذيبات من البروتين أحادية اللون. هناك عدة خطوات إضافية يمكن للمرء أن تتخذ لزيادة الكشف عن انخفاض التعديلات FPOP وفيرة، بما في ذلك الكروماتوغرافيا 2D، تجزئة تحت الخلية، وتقنيات تعدد البروتيوميكسينغ. مع استخدام FPOP في الخلية، يمكننا الآن تنفيذ البيولوجيا البروتيوميوستروتيكال لربط أفضل هياكل البروتين مع وظيفة الخلوية.

نظرًا لطول الموجة 248 نانومتر المطلوب لـ FPOP ، تأكد دائمًا من ارتداء نظارات واقية للأشعة فوق البنفسجية وملابس مناسبة لتجنب التعرض غير المقصود للإشعاع المنعك أو المتناثر.