تحليل عيوب القلب الخلقية في أجنة الفئران باستخدام أساليب النسيج النوعي والكمي

هذا البروتوكول يوحد تقنيات جديدة لتحليل الأنسجة بحيث يمكن استخدامها على نطاق أوسع من قبل مجموعات أخرى الذين يدرسون أيضا عيوب القلب الخلقية. وبما أن تقنيات التحليل النوعي والكمي لها مزاياها وعيوبها، فإن هذه المنهجية تستخدم كليهما لمعالجة أوسع نطاق من الأسئلة التجريبية. يمكن أن يكون لهذه التقنيات تأثير إيجابي على طرق تشخيص أمراض القلب.

على سبيل المثال، يمكن لأخصائيي علم الأمراض تطبيق تقنيات تحليل الأنسجة القلبية المجهرية لدينا لتشخيص أمراض القلب البشرية من عينات الخزعة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لأمراض القلب أو أبحاث أمراض القلب العامة. ومع ذلك، توفر هذه الطرق أيضا تقنيات مفيدة مختلفة التي يمكن تطبيقها نحو أي تحليل الأنسجة.

لجمع يوم الجنين 15 إلى 15.5 قلوب، وتأمين أطراف السد الحوامل والبدء في جميع أنحاء مجرى البول حتى القص، وجعل بعناية شق على شكل I على طول الجذع. باستخدام ملقط في حركة يغرف، ورفع بلطف الرحم من تجويف البطن استيعاب الأنسجة السطحية للرحم حسب الضرورة مع ملقط غرامة للمساعدة في الاستخراج. استخدم المقص لإطلاق الرحم من البطن.

بعد نقع الرحم في برنامج تلفزيوني بارد، قم بتشريح العضو في طبق تشريح. باستخدام مقص، وقطع الرحم إلى أقسام فردية تحتوي كل منها على جنين منفصل. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، قشر بلطف الأجنة من أنسجة الرحم ووضعها في لطبق بيتري جديد يحتوي على أربع درجات مئوية PBS-EDTA.

لجمع القلوب، ضع الطبق تحت مجهر تشريح واستخدم زوجين من ملقط غرامة لوضع الجنين في موقف supine. بعد تثبيت الوصول إلى الصدر، استخدم النقطة الحادة لزوج ثان من ملقط غرامة لجعل شق على طول القص للجنين تمتد بين الترقوة إلى السرة. صنع شقوق جيدة جدا وسطحية في حين تعمل تدريجيا نحو داخل تجويف الصدر، وفتح البطن من الجنين.

عندما يصبح القلب مرئيًا ، استخدم زوجًا من ملقط للضغط على الجذعدل قليلاً إلى القفص الصدري لقشر الأضلاع المفتوحة. باستخدام جانبي زوج واحد من ملقط، والاستيلاء بلطف على الأوعية الدموية الرئوية دون فصل الأنسجة وسحب القلب من تجويف. تنظيف القلب في برنامج تلفزيوني جديد-EDTA لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل تحديد الأنسجة في 4٪ Paraformaldehyde لمدة 45 إلى 60 دقيقة.

ثم، غسل القلب ثلاث مرات لمدة 5 إلى 10 دقائق لكل غسل في برنامج تلفزيوني تكمل مع الجليسين. قبل تخزين القلوب في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية. لإعداد القلب للتبريد، ضع العينات في أنبوب من 30٪ السكروز وبرنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية لمدة 24 إلى 40 ساعة.

عندما غرقت القلوب إلى أسفل الأنبوب ، استخدم Pipette باستور مع طرف معدل لنقل كل قلب بعناية إلى قطعة من مسح الوبر الحر. بعد تجفيف الهواء وجيزة، ضع كل عينة في الفردية المثلى قوالب درجة الحرارة القطع في التوجهات المطلوبة للقطع. غمر الأنسجة في المتوسط درجة الحرارة القطع الأمثل دون فقاعات.

ثم، وتخزين قوالب في 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى بضعة أيام قبل تجميد الأنسجة في 80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل قبل القاء الكرياض. للحصول على أقسام التبريد من العينات، واستخدام جديدة مثالية خفض درجة الحرارة المتوسطة لإرفاق كتلة الأنسجة من الفائدة إلى تشاك من التبريد والسماح للوسيط لتجميد حتى أنها بيضاء مبهمة. أدخل شفرة جديدة واضبط المسافة بين كتلة الأنسجة والشفرة للسماح بالحصول على المقاطع.

تقليم كتلة في 10 شرائح ميكرومتر حتى يتم الوصول إلى نقطة الفائدة. عندما يمكن ملاحظة الأنسجة، استخدم فرشاة طلاء مسطحة صغيرة لسحب الشريحة برفق ضد الحامل في حركة قطع مستمرة. مرة واحدة وقد تم قطع الأنسجة تماما من خلال، واستخدام فرشاة التفاصيل لبات شريحة أسفل شقة ضد المرحلة.

ضع القسم في مكانه لمدة 20 إلى 30 ثانية تقريبًا قبل إزالة الفرشاة التفصيلية والانتهاء من الشريحة. استخدام كل من فرش الطلاء لتسطيح بلطف شريحة ضد المرحلة منع أي المتداول وعقد قسم الأنسجة ضد المرحلة. بعد 20 إلى 30 ثانية، الوجه القسم وتتسطح على المرحلة مرة أخرى قبل وضع شريحة مشحونة كهربائيا قريبة بما فيه الكفاية للشريحة أن تنجذب والالتزام الشريحة دون الحاجة إلى لمس الشريحة إلى المرحلة.

لتقييم أقسام أنسجة القلب لوجود عيوب القلب الشائعة، وذلك باستخدام مجهر مجهز بكاميرا، الحصول على صور في 5 إلى 10X و 40X التكبير. لتحليل ضغط عضلة القلب، افتح نسيجًا مهمًا في برنامج تحليل الصور المناسب، وحدد الصورة على 8 بت. لتعيين عتبة الصورة، انقر فوق صورة، وضبط، وعتبة، ثم حرك الشريط العلوي لضبط العتبة حتى يتم تحديد وحدات البكسل فقط للخلفية.

بعد ذلك، استخدم أداة تحديدات المضلع لرسم منطقة ذات أهمية حول الأنسجة ثم انقر فوق تحليل، تعيين القياسات، المنطقة، والحد إلى العتبة. انقر فوق تحليل و قياس لقياس مساحة بكسل المميز للحصول على قيمة مساحة المساحة السالبة. لقياس المنطقة التي تهمك بأكملها، انقر فوق تحليل، تعيين القياسات، ثم قم بإلغاء تحديد حد العتبة.

ثم حدد تحليل وقياس لقياس المنطقة المحددة بالكامل. لحساب منطقة الأنسجة العضلية، اطرح مساحة المساحة السالبة من منطقة منطقة الاهتمام. ثم تقسيم منطقة الأنسجة العضلية من قبل منطقة منطقة الاهتمام لحساب ضغط العضلات و X.The تلطيخ شرائح الأنسجة من قلوب جنينية حصادها، ويوفر ما يكفي من التباين لجعل حواف الأنسجة، ولكن ليس الظلام بحيث تجعل ملامح الخلية لا يمكن التفريق.

في هذا التحليل التمثيلي، لوحظ أن ضغط العضلات قد انخفض بشكل كبير في القلوب التجريبية نسبة إلى الأجنة التي تطورت في ظروف غير تجريبية. هذه العينات قيمة وتتطلب وقتا طويلا لإنشاء. أثناء necropsies والقطع التبريد على وجه التحديد، تأكد من أن تكون متعمدة حول كل عمل تقوم به.

يحافظ الحفاظ على الأنسجة في Paraformaldehyde على نشاط المستضد الذي يسمح باستخدام العينات لاختبارات مثل تلطيخ Aminofluorescein الذي يساعد على تحديد الأسباب المرضية التي تم العثور عليها أثناء تقييم المورفولوجيا. في مختبرنا، حصلنا على تمثيل كمي للعلاجات التجريبية التي يمكن أن تساعدنا على تحديد الدرجة التي تؤثر بها العلاجات المختلفة على عيناتنا. يمكن لـ Paraformaldehyde إصلاح أي نسيج يلمسه.

احرص على ارتداء القفازات دائمًا لتقليل الجلد المكشوف والعمل في غطاء محرك الفيلم كلما كنت تعمل مع هذه المادة الكيميائية.