حية الخلية التصوير من Microtubule Cytoskeleton والتلاعب micromechanical من عربيدوبسيس تبادل لاطلاق النار Apical Meristem

هذا البروتوكول يساعدنا على فهم كيفية سلوك ميكروتوبول Cytoskeleton يحدث في النباتات. في الوقت نفسه، فإنه يساعدنا أيضا على فهم كيفية هذه المكونات الهيكلية التي تؤثر على شكل الخلية والجهاز، والاستجابة للتغيرات في القوى الميكانيكية. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة تتطلب القليل من التطور، إلا أنها توفر قراءة كمية قوية، وهي اختلافات الاستجابة الميكانيكية بين الأنماط الوراثية والظروف المختلفة.

تبدأ بزراعة بذور arabidopsis التي تعبر عن مجالات الربط microtubule تنصهر مع البروتين الفلورسنت الأخضر في التربة، في 20 و 6 درجات مئوية في ظل ظروف يوم طويل لمدة أسبوع واحد. بعد الإنبات، نقل الشتلات إلى أوعية جديدة مع مساحة نمو كافية للسماح بنمو نباتي قوي، ووضع النباتات في 20 و 16 درجة مئوية في ظل ظروف اليوم القصير. بعد ثلاثة إلى خمسة أسابيع، نقل النباتات مرة أخرى إلى ظروف اليوم الطويل في نفس درجة الحرارة حتى الترباس النباتات، مما يسمح للانفتاح أن تنمو ما يصل إلى 2-5 سم طويلة.

لتشريح Meristem التقطية، وضع الانفلات، واستخدام ملقط حادة لقشر الزهور في قاعدة peduncles، حتى أنه من الصعب أن نرى peduncles بالعين المجردة لإزالة براعم الزهور القديمة. استخدام ملقط لإنشاء شق في الزراعة في طبق تشريح، وزرع قاعدة إينفلورسنس في أوور سميكة. ضع الطبق تحت مجهر تشريح.

بدءا من أقدم برعم الزهور، ودفع مع ملقط لإزالة برعم زهرة من النبات. وعادة ما يتعرض التصوير meristem apical عندما تتم إزالة الزهور القديمة تصل إلى المرحلة السادسة إلى السابعة. واستخدام ملقط لدفع كل برعم زهرة إلى أسفل حتى تبادل لاطلاق النار meristem apical مرئية.

بمجرد أن يتعرض تبادل لاطلاق النار meristem apical ، والسماح للعينة تشريح حديثا في منتصف النمو في الايثانول المعقم مستطيلة البلاستيك يتوقف مربع الثقافة مع تبادل لاطلاق النار meristem apical فقط يتعرض فوق السطح المتوسط. إضافة بضع قطرات من الماء المعقم غير المؤين إلى حواف مربع الثقافة وإغلاق الغطاء للحفاظ على الرطوبة داخل منطقة الجزاء. التفاف مربع مع الشريط micropore، ووضع مربع النمو في ظل ظروف طويلة أو مستمرة اليوم في 22 درجة مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة.

عندما يكون النبات قد تعافى من إجراء التشريح ، قم بتغطية العينة بالماء المعقم والتحقق من فقاعات الهواء تحت المجهر التشريحي. نقل مربع الثقافة إلى مرحلة المجهر confocal تستقيم، واختيار عدسة غمس الماء 40 أو 60X. خفض الهدف في الماء والتحقق من فقاعات الهواء على العدسة الأمامية للكائن.

لإزالة الفقاعات، قم بخفض المرحلة ومسح العدسة برفق باستخدام نسيج بصري. ثم استخدام ماصة باستور لإضافة كمية صغيرة من الماء إلى العدسة الأمامية للهدف قبل إعادة غمر العدسة في الماء. بعد ذلك، استخدم فلتر GFP ووحدة إنارة النسل في المجهر confocal لضبط وحدة التحكم XY لتحديد مكان العينة.

ضبط موقف العينين، وضع التصوير meristem apical مباشرة تحت مصدر الضوء، والتركيز على طول المحور Z حتى يقع قمة. استخدام ليزر قادرة على GFP مثيرة لإلقاء الضوء على العينة، وضبط التكبير البصري للمجهر، بحيث تبادل لاطلاق النار كامل meristem والمرحلة واحدة primordia الأزهار هي في مجال الرؤية. ثم، ضبط قوة إخراج الليزر وإعدادات كسب للحصول على إشارة الأمثل إلى نسبة الضوضاء.

بعد السماح للعينة لتسوية لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق، والحصول على أكوام من 0.25 إلى 0.5 ميكرومترات Z شريحة الفواصل الزمنية، إضافة ما يقرب من 0.3 مايكرو متر بكسل القرار. في نهاية عملية الاستحواذ، قم بإزالة المياه على الفور ونقل مربع الثقافة مرة أخرى إلى غرفة النمو. لMimechanical تبادل لاطلاق النار Apical Meristem الانزعاج ، والحصول على مداخن صورة ما قبل الاجتثاث من منظمة microtubule القشرية كما أظهرت للتو ، وdeaf الماء من مربع الثقافة في طبق الثقافة.

نقل تبادل لاطلاق النار apical meristem تحت مجهر تشريح ، واقترب ببطء من تبادل لاطلاق النار apical meristem مع حقنة نظيفة 0.4 من قبل 20 ملليمتر إبرة الحقن. الاتصال لفترة وجيزة على محيط قبة من meristem تبادل لاطلاق النار apical مع طرف إبرة للتأكد من أن تم الانتهاء من الاستئصال. وإعادة ملء طبق الثقافة مع المياه الأيونية العقيمة.

ثم إضافة 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من يوديد بروبدييوم إلى الطبق والحصول على الفور أكوام الصورة كما هو موضح كل ساعتين لمدة ست ساعات، والعودة طبق الثقافة إلى الحضانة بين كل نقطة زمنية. لتحليل البيانات، توليد الإسقاطات السطحية من مداخن الصورة باستخدام برنامج تحليل الصور المناسبة، وتنفيذ استخراج النظائر المجهرية القشرية باستخدام ماكرو أداة فيبريل في فيجي. هنا، يمكن ملاحظة صور الإسقاط النموذجية التي تم الحصول عليها من خطوط نطاق الربط المجهري GFP مع الخلايا في وسط القبة التي تحتوي على جيوتومات القشرية غير المنظمة، والخلايا في المحيط، وجود توزيع محيطي وخلايا نطاق حدودية تحتوي على ميكروتوبولات القشرية المنحازة بالتوازي مع محور الخلية الطويل.

تصوير الفاصل الزمني، يظهر محاذاة ميكروتوبول القشرية المتغيرة من مجموعة شديدة الاضطراب إلى مجموعة أكثر تنظيما في غضون ست ساعات من الاستئصال. يمكن فرضها على التوزّر على صور ميكروتوبي القشرية، ويمكن تمثيل المعلومات المستخرجة من خلال رسم النظائر الوسطية مع مرور الوقت. عند ضبط قوة إخراج الليزر وإعدادات الحصول عليها ، يجب أن نضمن أن مراقبة واضحة للخيوط ومحاولة تجنب التعرض المفرط ، حيث أن الإشارات المشبعة يمكن أن تحيز اتجاه الشد في التحليل اللاحق.

يمكن أيضًا إجراء المجهر المجهري للقوة الذرية لتقييم كيفية تأثير التغيرات في القوى الميكانيكية فعليًا على الحالة المادية لسور الخلية.