الجر قوة المجهر لدراسة B تنشيط الخلايا الليمفاوية

هذه الطريقة تجعل من الممكن لقياس التوزيع الزماني المكاني للقوات التي تطبقها الخلايا B في المشبك المناعي وربطها مع تجنيد بروتينات محددة. الجر قوة المجهر باستخدام الجل polyacrylamide من السهل تنفيذ. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإعداد قياس القدرات الميكانيكية للعديد من الخلايا B بسرعة.

هذه الطريقة مرنة ويمكن تكييفها للرسم البياني يغاندس أخرى مثل integrins أو لدراسة أنواع أخرى من نقاط الاشتباك العصبي المناعي مثل الخلايا التائية أو البلعمة بالاحباط. نظراً للخصائص الفيزيائية والكيميائية للجل المطلوبة من قبل هذه التجربة، قد يكون تكييف أساليب المجهر قوة الجر الكلاسيكية إلى الخلايا B صعبة. تبدأ من قبل ملوحة دعم هلام.

قم بتفعيل طبق الأغطية أو الزجاج السفلي بيتري بمصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين، ثم قم بتملحه بـ 200 ميكرولتر من APTMS لمدة خمس دقائق. هذا سوف يعد الدعم للربط التساهمي للجل. غسل جيدا الأغطية أو طبق القاع الزجاج مع المياه النقية جدا وتجفيفه باستخدام فراغ الطموح.

لإعداد الأغطية لتسطيح الجل ، ووضعها في حامل أغطية السيراميك ، ووضع حامل في الكوابر الصغيرة ، وصب الكواشف السيليكون على الأغطية مع التأكد من تغطيتها تماما. تغطية كوب مع رقائق الألومنيوم وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. وفي الوقت نفسه، ملءقار كبير مع المياه النقية جدا.

بعد ثلاث دقائق من الحضانة في الكاثافة السيليكون، نقل حامل الغطاء مع الأغطية إلى الكوابر مع الماء. شطف جيدا الأغطية مع المياه النقية جدا. جففها جيداً ووضعها على مناديل ورقية.

للحصول على أفضل النتائج، والمضي قدما على الفور مع البلمرة هلام. إعداد 500 باسكال هلام قبل المزيج وفقا لاتجاهات المخطوطات، ثم الجمع بين 167 ميكرولترات من ما قبل مزيج مع 1.67 ميكرولترات من الخرز. دوامة و sonicate الخليط في حمام sonicator لمدة خمس دقائق.

حماية المزيج من الضوء مع رقائق الألومنيوم. للاستفادة من البلمرة، إضافة 1.67 ميكرولترات من 10٪ persulfate الأمونيوم إلى مزيج هلام، ثم بدء البلمرة عن طريق إضافة 0.2 ميكرولترات من TEMED وخلط الجل مع ماصة. لإلقاء الجل، ماصة تسعة ميكرولترات من مزيج هلام على كل غطاء ملوحة أو طبق القاع الزجاج.

على الفور تسطيح الجل مع غطاء سيليكوني، والضغط عليه مع ملقط لضمان أن ينتشر هلام عبر المنطقة بأكملها من غطاء وأن بعض من تسرب بها. عكس غطاء أو طبق القاع الزجاجي في طبق بيتري كبير والاستفادة منه على مقاعد البدلاء لإجبار الخرز نحو سطح هلام. ضع نسيجًا مرطبًا على الطبق لإنشاء غرفة رطبة.

غطيه بورق الألمنيوم واحتضانه لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، وتسهيل الافراج عن غطاء بإضافة برنامج تلفزيوني للعينة. إزالة بعناية غطاء مع إبرة، إمالة قليلا الطبق ولكن التأكد من أن يتم غمر هلام في برنامج تلفزيوني.

يمكن أن يكون عامل السيليكون ، الأكريلاميد ، الأكريلاميد الأساسي ، وTEMED سامًا عن طريق الاستنشاق. ارتداء معدات الحماية الشخصية القياسية والتلاعب هذه المنتجات تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. استلهم برنامج تلفزيوني من المواد الهلامية وإضافة 150 ميكرولترات من Sulfo-SANPAH في درجة حرارة الغرفة.

تعريض الجل للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين ، ثم غسل الجل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. كرر العلاج مع Sulfo-SANPAH ويغسل PBS ، ثم إضافة 250 ميكرولترات من البيض lysozyme أو HEL إلى الجل واحتضانه بين عشية وضحاها في غرفة الرطوبة في أربع درجات مئوية مغطاة برقائق الألومنيوم. بعد الحضانة، وإزالة مستضد HEL وغسل هلام مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.

وأخيرا، تغطية هلام مع 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام ثقافة الخلية B وترك الأمر في درجة حرارة الغرفة. استخدم مجهرًا مشتركًا مع التحكم الحراري وثاني أكسيد الكربون في التصوير. التعرق وسائل الإعلام من هلام، وترك ما يقرب من 200 ميكرولترات.

ضع الجل على المجهر. وسوف تظهر طبقتين رئيسيتين من الخرز في الجزء السفلي والجزء العلوي من هلام. التركيز على الطائرة هلام والعثور على منطقة حتى الصورة.

اختر منطقة التصوير بعناية وتأكد من التركيز. كثافة حبة مناسبة وسطح زوجي هي المفتاح للحصول على قياسات قوة قوية وموثوق بها. أضف 80 ميكرولترات من الخلايا الليمفاوية B الأولية من فئران MD4 إلى الجل، وتجنب لمس الجل للحفاظ على التركيز.

تأكد من أن التركيز لا يزال صحيحاً وأن الخلايا يمكن أن ينظر إليها تنازلي في المنطقة. إطلاق اقتناء قبل الخلايا تصل إلى هلام. افتح الفيلم ككدسة من الصور في ImageJ، ثم قم بتشغيل cropandsave.ijm الماكرو.

اختر دليل إخراج وتكوين إعدادات قناة السمة. حدد المناطق ذات الأهمية باستخدام أداة المستطيل وإضافتها إلى قائمة العائد على الاستثمار باستخدام مفتاح T. عند الانتهاء، انقر فوق موافق. عندما يقترح الماكرو قناع الخلية انقر فوق موافق إذا كان مرض.

إذا لم تكن مرضية، انقر فوق لا موافق ثم حدد يدويا منطقة مغلقة مع أي أداة التحديد، ثم انقر فوق متابعة. فتح MATLAB وتشغيل tfmv1.m. إدخال المعلمات المطلوبة.

على وجه التحديد، تحقق من خصائص الصورة، مثل حجم البيكسل والفاصل الزمني للاكتساب وخصائص الجل مثل معامل الشباب E ونسبة بواسون. عند الانتهاء، حدد موقع مخرجات البرنامج في نفس الدليل مثل الملف الأصلي. تبدو صور الخرزة الصحيحة وكأنها توزيع موحد وعشوائي للبقع المضيئة المشابهة للسماء المرصعة بالنجوم.

البيانات والتحليل لا يمكن الاعتماد عليها عندما يكون عدد الخرز منخفض جدا أو الصورة خارج التركيز. فمن الممكن لمراقبة حركة الخرز بالعين باستخدام الإطار المرجعي الذي سبق أول اتصال من الخلية مع الركيزة. ويمكن الحصول على النتائج التقريبية من تتبع الجسيمات الواحدة.

يوفر التحليل تجزئة الخرز في الصورة المرجعية كتحكم. باستخدام البرمجيات ، فمن الممكن أيضا للحصول على النزوح والإجهاد الميدان ، الذي هو متجه من الإجهاد المحلية في كل بكسل وكل نقطة زمنية. يوفر المنتج العددي لحقول النزوح والقوة المتكاملة على منطقة الخلية العمل الكلي الذي تقوم به الخلية على الركيزة.

عند مقارنة شرطين بيولوجية، يمكن حساب منحنى متوسط أو متوسط قيمة خلال آخر نقطة زمنية حيث تصل الطاقة إلى هضبة. عندما المعلومات المكانية للقوات ذات الصلة، فمن الممكن أيضا لمقارنة نقطة زمنية واحدة من كل شرط. ويرد هنا مثال على التهجين المضاد المفلور.

يشير المظهر التدريجي للإشارات الفلورية في المشبك إلى انفصال المستضد عن الجل. ويمكن استخدام بيانات الفلوريسنس لبناء منحنى استخلاص متوسط. الخطوة الأكثر حساسية في البروتوكول هو البلمرة من هلام تحت غطاء.

يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بسرعة نسبية وبعناية ضمان أن يتم ضغط هلام بشكل موحد تحت غطاء. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام البروتين الفلوري الذي يعبر عن الخلايا الليمفاوية B لتقييم توطين الهياكل داخل الخلايا ونقش القوة في وقت واحد. ويمكن الجمع بين هذه التقنية والتشوهات الوراثية أو الكيميائية لتقييم دور بروتينات محددة على قابلية الخلية للتقلص والإقبال على المستضد.