إجراء خزعات قرصة مُرشدة بالمنظار في الفئران وتقييم التغيرات اللاحقة في الأنسجة

توفر هذه الطريقة طريقة مثالية لدراسة التئام الجروح في القولون والتغيرات الجزيئية والهودية التي تحدث بعد الإصابة. ويمكن لهذه الطريقة أيضا تسليط الضوء على مرض الإمراض IBD. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي السيطرة بدقة على موقع الإصابة وتوقيت عملية التئام الجروح.

الأفراد الذين يؤدون هذه الطريقة للمرة الأولى قد يجدون صعوبة في إدخال منظار القولون في القولون الماوس وخلق الجروح متسقة. وينبغي أن الممارسة المتكررة لهذه التقنيات التغلب على هذه القضايا. نظرا للخطوات المنسقة المتعددة والفروق الدقيقة التي ينطوي عليها هذا الإجراء، فإن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية.

قبل البدء في الإجراء، أدخل 1.9 ملليمتر جامدة المنظار تتحمل في اِلماع المنظار. وإرفاق المنظار المجمع بمصدر الضوء وجهاز تصوير الفيديو حسب تعليمات الشركة المصنعة. استخدم الأنابيب المقدمة لإرفاق مضخة الهواء بصمام الغاز على الجانب الأيسر من الدارف بجانب قناة العمل.

تأكد من أن قناة العمل في وضع مفتوح وأدخل ثلاثة ملقط خزعة فرنسية من خلال قناة العمل. تقدم ملقط إلى نهاية اجد دون جاحظ من اجد من ا. بعد ذلك، ضع الماوس المُجرّد على منصة التدريج بالمنظار على جانبها البطني، وتأكد من المستوى المناسب من التخدير بسبب عدم الاستجابة لدواسة منعكسة.

بعد تطبيق مرهم العين، ملء حقنة ثلاثة ملليلتر مع إبرة فئران المرفقة مع درجة حرارة الغرفة PBS. وأدخل الإبرة حوالي سنتيمتر واحد في فتحة الشرج للماوس. يغرس بلطف مع برنامج تلفزيوني حتى تم مسح المواد البراز.

يجب أن تخرج العديد من الكريات البراز الماوس جنبا إلى جنب مع برنامج تلفزيوني التي تم غرسها. أدخل المنظار المجمع 0.5 سنتيمتر في فتحة الشرج وتقدم ملقط الخزعة في تجويف المستقيم المطّل حتى يصبح الفك الكامل للملبوسات أبعد من نهاية العغم. بدوره ملقط 90 درجة بحيث فتح الفكين في اتجاه الشرق والغرب وفتح النصائح وتقدم ملقط ما يقرب من سنتيمتر واحد، وإغلاق وتراجع الملباب في واحد على نحو سلس، حركة سريعة لحصاد الخزعة.

لتجنب تحشوة القولون بالكامل أثناء إجراء الخزعة، اترك الجانب الأيمن من صمام الغاز مفتوحًا. بعد الخزعة مباشرة، قم بالاكتئاب على دواسة القدم المرفقة بجهاز تسجيل منظار القولون لبدء تسجيل الفيديو. واضغط بقوة على السبابة ضد الجانب الأيمن من صمام الغاز لتغطية تماما فتح، مما اضطر الهواء في المنظار وبالتالي في القولون.

سحب ملقط مرة أخرى للخروج من العاد وإلى تجويف المستقيم بينما في موقف مغلق. ووضع ملقط ضد الجدار المستقيم مباشرة فوق الجرح حتى يتم محاذاة قاعدة الفكين مع الحافة العليا من حقل المشاهدة. استمر في اِلتفرح القولون بالكامل حتى يمكن ملاحظة رؤية واضحة للجرح.

للحصول على أفضل القياسات من السرير الجرح، والصبر ثم وضع منظار القولون في زاوية دقيقة بحيث تحصل على أفضل صورة للسرير الجرح. افتح الفيديو في برنامج برنامج مناسب وتقدم الفيديو إلى إطار يظهر نقطة زمنية يمكن فيها تصور سرير الجرح بسهولة. والتي تكون فيها ملقط مغلقة فوق سرير الجرح وضد جدار المستقيم ، والجدار مشدود.

في كل نقطة زمنية، الحصول على لقطة من هذا الإطار ورمز اسم الملف لضمان أن يتم إجراء قياسات الأسرة الجرح بطريقة عمياء. لتحديد حجم سرير الجرح، افتح الصور في ImageJ واستخدم أداة التحديدات اليدوية الحرة لرسم محيط حول الجرح. ضمن تحليل، حدد قياس.

وقيمة هذا القياس سوف تملأ تلقائيا في إطار النتائج. عند الحصول على جميع القياسات، حساب حجم الجرح في الأيام اللاحقة نسبة إلى حجم في اليوم صفر في جدول بيانات. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، افتح الجلد وطبقات عضلات البطن لفضح تجويف الجسم للحيوان التجريبي ووضع ملقط مغلقة تحت القولون.

رفع بلطف القولون لتحريره من mesentery الكامنة وقطع الأنسجة في منتصفها وعند فتحة الشرج لجمعه من الماوس. استخدام حقنة 20 ملليلتر مليئة PBS الجليد الباردة ومجهزة بإبرة فئران لطرد محتويات البراز. ووضع القولون مسح على قطعة من ورقة التصفية.

فتح طولي القولون، مع الحرص على أن الجانب mesenteric هو وجه لأسفل ضد ورقة التصفية. واستخدم ماصة باستور لتغطية الغشاء المخاطي بـ 0.2٪ من الميثيلين الأزرق. بعد بضع ثوان، استنزف البقعة الزائدة وعرض القولون تحت مجهر تشريح لتحديد مكان سرير الجرح.

استخدام أربعة بوصة مقص إيريس مايكرو لقطع حول حافة السرير، مع الحرص على عدم قطع في طبقة العضلات. واستخدام ملاقط نقطة غرامة لنقل الأنسجة تشريح في أنبوب لتجميد المفاجئة أو التخزين. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، افتح القولون المقطوع طولياً على قطعة من ورق المرشح، الجانب المساريقي لأسفل.

غطي الأنسجة بلطف مع تثبيت اختيارك. تغطية الأنسجة مع parafilm في حاوية مختومة لمدة 4 إلى 6 ساعات قبل التخزين في 70٪ الإيثانول. في يوم المعالجة، وإزالة البارا فيلم وإضافة 0.2٪ الميثيلين الأزرق إلى الأنسجة، كما هو موضح.

بعد استنزاف قبالة وصمة عار الزائدة، ووضع الأنسجة تحت المجهر تشريح لتحديد مكان السرير الجرح. باستخدام مشرط مع شفرة رقم 10 ، وقطع مباشرة من خلال مركز السرير الجرح ومواصلة قطع من خلال ما تبقى من القولون في خط مستقيم ، بحيث يتم قطع القولون في نصف طول. لتكرير، تضمين قطع القولون بحيث الجانب الذي تم قطعه من قبل مشرط هو الوجه إلى أسفل في قالب قاعدة نصف مليئة بالأنسجة تجميد المتوسطة.

تأمين الأنسجة في مكان مع ملاقط غرامة ووضع القالب قاعدة على لوحة معدنية أو رقائق سميكة من الألومنيوم على رأس الجليد الجاف لتصلب المتوسطة تجميد. مرة واحدة يتم تجميد الجزء السفلي من المتوسطة، وملء حجم المتبقي من القالب قاعدة مع تجميد المتوسطة في درجة حرارة الغرفة. وإرجاع القالب إلى الثلج الجاف حتى يتم تجميد كتلة الأنسجة بأكملها.

ثم، نقل القالب إلى ثلاجة 80 درجة مئوية حتى قسم. هنا، تظهر صور تمثيلية من وجهات النظر المقبولة من سرير الجرح من أجل تحديد دقيق لحجم سرير الجرح ومعدل إغلاق الجرح. في هذا المنظر السابق vivo من سرير الجرح، يمكن ملاحظة مؤشرات محيط سرير الجرح وحيث لقطع الأنسجة لتمكين التصور من سرير الجرح على قسمة.

في هذه الصورة التمثيلية، يمكن ملاحظة قسم وصمة عار H و E من سرير الجرح بوضوح. من المهم الحصول على صور فورية من السرير الجرح في جميع النقاط الزمنية لضمان تقييم دقيق لمعدل التئام الجروح. بعد خزعة قرصة، يمكن حقن وكلاء مختلفة من الفائدة في السرير الجرح لاختبار آثارها على معدل التئام الجروح.