إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة
يونيو 8, 2020
نحن نقدم بروتوكول وضع العلامات الكتلية المترادفية الأمثل (TMT) الذي يتضمن معلومات مفصلة لكل من الخطوات التالية: استخراج البروتين، والقياس الكمي، وهطول الأمطار، والهضم، ووضع العلامات، والخضوع لمرفق البروتيوميات، وتحليل البيانات.
الفوائد الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يقلل من تكاليف وضع العلامات، ويحسن استخراج البروتين، ويولد بيانات عالية الجودة. المزايا الرئيسية لبروتوكولنا هي كفاءة وضع العلامات العالية لأنواع مختلفة من العينات ، القابلية لإعادة إنتاجها ، واقتناء البيانات الموثوقة. بعد عزل عينات من أنسجة العضلات رباعية من فأر القتل الرحيم وفقا لبروتوكول وافق IACUC، تزن بها 10 ملليغرام من أنسجة العضلات واستخدام ملاقط لفصل ألياف العضلات.
لإنشاء lysate، نقل عينة الأنسجة المنفصلة إلى أنبوب ملليلتر اثنين تحتوي على 200 ميكرولترات من حبات السيليكا الزركونيا ملليمتر واحد و 500 ميكرولترات من حاجز تحلل CHAPS. ضع العينات في خرزة تعطيل وتنفيذ اثنين من أشواط 45 ثانية متتالية. بعد الدورة الثانية، للافراج عن البروتين DNA ملزمة، سونيكات العينة 10 مرات لمدة 10 ثانية لكل سونيكيشن في 50٪ السعة مع فترات 30 ثانية على الجليد.
بعد صوتنة الماضي، الطرد المركزي وlysate ونقل sunatant إلى أنبوب جديد للطرد المركزي. للحد من / alkylating العلاج الكاشف، ونقل 200 ميكروغرام من البروتين في كل حالة في أنابيب جديدة للطرد المركزي واستخدام جديدة CHAPS تحلل العازلة لجلب الحجم النهائي في كل أنبوب تصل إلى 100 ميكرولترات. بعد ذلك، إضافة خمسة ميكرولترات من TCEP إلى كل أنبوب واحتضان العينات في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
في نهاية الحضانة، قم بحل تسعة ملليغرام من iodoacetamide في 132 ميكرولترات من 100 ملليمولار TEAB وحماية الناتج 375 ميل iodoacetamide مليمولار من الضوء. ثم إضافة خمسة ميكرولترات من iodoacetamide إلى كل عينة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. بالنسبة لهطول الأمطار بالميثانول/الكلوروفورم، أضف 400 ميكرولتر من الميثانول إلى كل 100 ميكرولتر من البروتين ودوامة العينات لفترة وجيزة.
لدمج السوائل المودعة على جانبي أنابيب العينة، طرد مركزي لفترة وجيزة العينات وإضافة 100 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى كل أنبوب. بعد دوامة وجيزة، بسرعة الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى لجمع السائل على جانبي الأنابيب وإضافة 300 ميكرولترات من الماء إلى العينات. دوامة بقوة للحصول على حلول متجانسة وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة دقيقة واحدة في ظل نفس شروط أجهزة الطرد المركزي.
في نهاية جهاز الطرد المركزي، نقل الأنابيب بعناية إلى رف دون إزعاج الطبقات وإزالة بعناية فائقة. إضافة 300 ميكرولترات من الميثانول إلى المراحل البينية والسفلى المتبقية ودوامة العينات بقوة مرة أخرى. الطرد المركزي العينات لمدة دقيقتين وpirate بعناية طاردات.
ثم pirate بلطف قدر السائل من كل عينة ممكن تحت تيار من الهواء حتى الكريات هي مجرد رطبة قليلا. تقييم الترطيب كل دقيقتين لمدة 10 دقائق. إذا لزم الأمر، يمكن تخزين الكريات في ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
لهضم البروتين، resuspend بيليه عجلت في 100 ميكرولترات من العازلة تحلل TEAB وإضافة 100 ميكرولترات من محلول تخزين التربسين إلى الجزء السفلي من 100 ميكروغرام التربسين الزجاج القارورة. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 2.5 ميكرولترات من محلول التربسين الطازجة المعدة لكل 100 ميكروغرام من البروتين لكل عينة واحتضان العينات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لوضع العلامات الببتيد, حل كل 0.8 ملليغرام TMT قارورة العلامة مع 41 microliters من الأسيتونيتريل اللامائية لكل علامة واحتضان الكواشف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع دوامة عرضية مع الحفاظ على التسميات المحمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، والطرد المركزي لفترة وجيزة قارورة وإضافة بعناية 41 ميكرولتر من كاشف تسمية TMT إلى كل عينة 100 ميكرولتر لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، أطفئ ردود الفعل مع إضافة ثمانية ميكروليترات من 5 ٪ هيدروكسيلامين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم تقسيم العينات إلى اسكوت متساوية في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الجديدة لتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية.
في هذا الاكتساب التمثيلي للبيانات، تم تحليل 39,653 من إجمالي الببتيدات، منها 4,457 كان لها تساوي أو أكثر من اثنين من الببتيدات الفريدة و3، 829 شملت أيونات المراسل لجميع القنوات. تم استخدام قطع تغيير أضعاف لتحديد التوزيع النسبي للبروتينات من المرضى مقارنة بالخلايا السليمة مع 296 بروتينات من وفرة أقل بكثير و 108 بروتينات من وفرة أعلى بكثير لوحظ. أظهر تحليل PANTHER قائمة مصنفة من البروتينات استنادًا إلى وفرة أقل بكثير أو أعلى من الخلايا المريضة استنادًا إلى وظيفتها الجزيئية.
تحليل سلسلة من البروتينات من وفرة أقل بكثير أو أعلى تحديد مزيد من التفاعلات المتعددة والارتباطات القوية بين البروتينات. يمكن تنفيذ طرق إضافية لتحديد التفاعلات البروتينية إلى البروتين، لتصنيف التفاعلات حسب المجموعات، وتحديد التفاعلات في مجموعة متنوعة من المسارات. تقنيات البروتيوميكس هي أدوات قوية في مجالات البحوث الطبية الحيوية لفهم آليات تطور المرض من خلال توفير معلومات مفصلة وفرة البروتين.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً محسنًا لتسمية علامة الكتلة الثنائية (TMT) لتحليل البروتين. توضح المقالة الخطوات المتبعة، بما في ذلك استخراج البروتين، وتحديد الكمية، وتحليل البيانات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم البروتينات
- الكيمياء الحيوية
- البحث الطبي الحيوي
الخلفية
- تسمية TMT هي تقنية قوية لعلم البروتينات الكمي.
- توليد بيانات عالية الجودة أمر بالغ الأهمية لفهم ديناميكيات البروتين.
- تعزز طرق استخراج البروتين الفعالة موثوقية التحليلات البروتينية.
- البروتوكولات منخفضة التكلفة ضرورية للانتشار الواسع في البحث.
هدف الدراسة
- تحسين بروتوكول تسمية TMT لزيادة الكفاءة وقابلية التكرار.
- توفير خطوات إجرائية مفصلة للباحثين.
- تسهيل الحصول على بيانات عالية الجودة في علم البروتينات.
الطرق المستخدمة
- عزلة عينات أنسجة العضلات من الفئران.
- استخراج البروتين باستخدام محلول تحلل CHAPS وتدمير الكريات.
- اختزال الألكيلة للبروتينات قبل الهضم.
- تسمية الببتيدات باستخدام علامات TMT وتحليل البيانات اللاحق.
النتائج الرئيسية
- تم تحليل ما مجموعه 39,653 ببتيدًا، مما كشف عن تغيرات كبيرة في وفرة البروتين.
- أظهرت 296 بروتينًا وفرة أقل، بينما أظهرت 108 بروتينًا وفرة أعلى في الخلايا المريضة.
- صنف تحليل PANTHER البروتينات بناءً على وظائفها الجزيئية.
- حدد تحليل String التفاعلات بين البروتينات ذات الوفرة المتفاوتة.
الاستنتاجات
- يعزز بروتوكول TMT المحسن كفاءة التسمية وجودة البيانات.
- توفر تقنيات علم البروتينات رؤى حول آليات المرض.
- يمكن للدراسات الإضافية استكشاف تفاعلات البروتين والمسارات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This optimized TMT labeling protocol enables cost-effective, high-throughput quantitative proteomics for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By delivering reproducible protein abundance data across diverse sample types, it supports predictive confidence in lead identification and portfolio triage decisions. The method reduces technical variability, enhancing cross-functional alignment between discovery biology and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides quantitative dependent variable measurements for pathway clarification and biological de-risking.
- Predictive Value: Supports target confidence by identifying significantly altered proteins between diseased and healthy states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible peptide-level readouts for reliable compound screening campaigns.
- Operational Value: Delivers high labeling efficiency and low reagent consumption, improving assay scalability and cost efficiency.
- Assay Readiness: Produces validated biological systems ready for downstream workflows including phenotypic screening and biomarker discovery.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates biomarker alignment by categorizing proteins based on molecular function via PANTHER analysis.
- Mechanistic De-risking: Identifies protein-protein interactions and pathway associations through String analysis, reducing mechanistic ambiguity.
- Preclinical Model Relevance: Demonstrated applicability in mouse tissues and cultured cells, supporting disease model validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling data-driven progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via quantitative proteomic profiling of treated versus control conditions.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible protein extraction, digestion, and labeling workflows suitable for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements including fold change cutoffs and reporter ion detection for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through protein interaction mapping and functional categorization.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable proteomics capability applicable across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and enhanced biological insight.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalable protein extraction and labeling across diverse sample types.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced labeling costs, and decreased late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on robust protein abundance changes and pathway-level insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics sample preparation, including protein quantification and handling of labeling reagents.
- Needs access to bead disruptors, sonicators, centrifuges, and LC-MS/MS systems for data acquisition.
- Demands cross-team standardization of lysis, precipitation, and labeling protocols to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations for varying tissue types and cell culture models while maintaining labeling efficiency.
- Involves practical limitations related to sample input requirements and the need for careful handling of TMT tags to prevent degradation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:31
Protein Extraction
1:40
Reducing/Alkylating Reagent Treatment
2:39
Methanol/Chloroform Precipitation
4:20
Protein Digestion
4:56
Peptide Labeling
5:57
Results: Representative Protein Quantification and Volcano Plot and Protein Analysis through Evolutionary Relationships (PANTHER) Analyses
7:04
Conclusion
