إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

الفوائد الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يقلل من تكاليف وضع العلامات، ويحسن استخراج البروتين، ويولد بيانات عالية الجودة. المزايا الرئيسية لبروتوكولنا هي كفاءة وضع العلامات العالية لأنواع مختلفة من العينات ، القابلية لإعادة إنتاجها ، واقتناء البيانات الموثوقة. بعد عزل عينات من أنسجة العضلات رباعية من فأر القتل الرحيم وفقا لبروتوكول وافق IACUC، تزن بها 10 ملليغرام من أنسجة العضلات واستخدام ملاقط لفصل ألياف العضلات.

لإنشاء lysate، نقل عينة الأنسجة المنفصلة إلى أنبوب ملليلتر اثنين تحتوي على 200 ميكرولترات من حبات السيليكا الزركونيا ملليمتر واحد و 500 ميكرولترات من حاجز تحلل CHAPS. ضع العينات في خرزة تعطيل وتنفيذ اثنين من أشواط 45 ثانية متتالية. بعد الدورة الثانية، للافراج عن البروتين DNA ملزمة، سونيكات العينة 10 مرات لمدة 10 ثانية لكل سونيكيشن في 50٪ السعة مع فترات 30 ثانية على الجليد.

بعد صوتنة الماضي، الطرد المركزي وlysate ونقل sunatant إلى أنبوب جديد للطرد المركزي. للحد من / alkylating العلاج الكاشف، ونقل 200 ميكروغرام من البروتين في كل حالة في أنابيب جديدة للطرد المركزي واستخدام جديدة CHAPS تحلل العازلة لجلب الحجم النهائي في كل أنبوب تصل إلى 100 ميكرولترات. بعد ذلك، إضافة خمسة ميكرولترات من TCEP إلى كل أنبوب واحتضان العينات في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

في نهاية الحضانة، قم بحل تسعة ملليغرام من iodoacetamide في 132 ميكرولترات من 100 ملليمولار TEAB وحماية الناتج 375 ميل iodoacetamide مليمولار من الضوء. ثم إضافة خمسة ميكرولترات من iodoacetamide إلى كل عينة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. بالنسبة لهطول الأمطار بالميثانول/الكلوروفورم، أضف 400 ميكرولتر من الميثانول إلى كل 100 ميكرولتر من البروتين ودوامة العينات لفترة وجيزة.

لدمج السوائل المودعة على جانبي أنابيب العينة، طرد مركزي لفترة وجيزة العينات وإضافة 100 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى كل أنبوب. بعد دوامة وجيزة، بسرعة الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى لجمع السائل على جانبي الأنابيب وإضافة 300 ميكرولترات من الماء إلى العينات. دوامة بقوة للحصول على حلول متجانسة وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة دقيقة واحدة في ظل نفس شروط أجهزة الطرد المركزي.

في نهاية جهاز الطرد المركزي، نقل الأنابيب بعناية إلى رف دون إزعاج الطبقات وإزالة بعناية فائقة. إضافة 300 ميكرولترات من الميثانول إلى المراحل البينية والسفلى المتبقية ودوامة العينات بقوة مرة أخرى. الطرد المركزي العينات لمدة دقيقتين وpirate بعناية طاردات.

ثم pirate بلطف قدر السائل من كل عينة ممكن تحت تيار من الهواء حتى الكريات هي مجرد رطبة قليلا. تقييم الترطيب كل دقيقتين لمدة 10 دقائق. إذا لزم الأمر، يمكن تخزين الكريات في ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.

لهضم البروتين، resuspend بيليه عجلت في 100 ميكرولترات من العازلة تحلل TEAB وإضافة 100 ميكرولترات من محلول تخزين التربسين إلى الجزء السفلي من 100 ميكروغرام التربسين الزجاج القارورة. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 2.5 ميكرولترات من محلول التربسين الطازجة المعدة لكل 100 ميكروغرام من البروتين لكل عينة واحتضان العينات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لوضع العلامات الببتيد, حل كل 0.8 ملليغرام TMT قارورة العلامة مع 41 microliters من الأسيتونيتريل اللامائية لكل علامة واحتضان الكواشف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع دوامة عرضية مع الحفاظ على التسميات المحمية من الضوء.

في نهاية الحضانة، والطرد المركزي لفترة وجيزة قارورة وإضافة بعناية 41 ميكرولتر من كاشف تسمية TMT إلى كل عينة 100 ميكرولتر لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، أطفئ ردود الفعل مع إضافة ثمانية ميكروليترات من 5 ٪ هيدروكسيلامين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم تقسيم العينات إلى اسكوت متساوية في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الجديدة لتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية.

في هذا الاكتساب التمثيلي للبيانات، تم تحليل 39,653 من إجمالي الببتيدات، منها 4,457 كان لها تساوي أو أكثر من اثنين من الببتيدات الفريدة و3، 829 شملت أيونات المراسل لجميع القنوات. تم استخدام قطع تغيير أضعاف لتحديد التوزيع النسبي للبروتينات من المرضى مقارنة بالخلايا السليمة مع 296 بروتينات من وفرة أقل بكثير و 108 بروتينات من وفرة أعلى بكثير لوحظ. أظهر تحليل PANTHER قائمة مصنفة من البروتينات استنادًا إلى وفرة أقل بكثير أو أعلى من الخلايا المريضة استنادًا إلى وظيفتها الجزيئية.

تحليل سلسلة من البروتينات من وفرة أقل بكثير أو أعلى تحديد مزيد من التفاعلات المتعددة والارتباطات القوية بين البروتينات. يمكن تنفيذ طرق إضافية لتحديد التفاعلات البروتينية إلى البروتين، لتصنيف التفاعلات حسب المجموعات، وتحديد التفاعلات في مجموعة متنوعة من المسارات. تقنيات البروتيوميكس هي أدوات قوية في مجالات البحوث الطبية الحيوية لفهم آليات تطور المرض من خلال توفير معلومات مفصلة وفرة البروتين.