المعاوقة القائمة على قياس في الوقت الحقيقي من هجرة الخلايا السرطانية والغزو

وباستخدام هذا البروتوكول، يمكن الكشف عن هجرة الخلايا والغزو في ظل ظروف آنية تمكن من تحديد حركية الخلايا في ظل فقدان أو كسب وظيفة الجينات والأدوية. على عكس الطرق الأخرى، لا تلطيخ، تلف الخلايا الميكانيكية، أو علامات الفلورسنت اللازمة. والأهم من ذلك، يمكن تحديد حركية الخلايا في الوقت الحقيقي بطريقة فعالة.

عندما تصل ثقافة خط الخلية U-118MG إلى 70 إلى 80٪، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل معالجة الخلايا مع مليلتر اثنين من 0.5٪ التربسين-EDTA. بعد 30 ثانية في 37 درجة مئوية، ووقف رد فعل مع 10 ملليلتر من الثقافة الطازجة المتوسطة ونقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. بعد العد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ست مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز الشرط في الحجم المناسب من المتوسطة الطازجة.

نقل ست مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في أنبوب واحد microcentrifuge لكل حالة وإضافة 800 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني دولبيكو إلى كل أنبوب. بعد الطرد المركزي، resuspend كل بيليه في 60 ميكرولترات من resuspension العازلة R وستة micromolar من سيرنا من الفائدة. اخلط كل أنبوب مع التنصت اللطيف قبل الكهربة 10 ميكرولتر أكوت من كل تعليق خلية مع ثلاث نبضات 10 مللي ثانية 1، 350 فولت.

بعد كل علاج، تجمع الخلايا الكهربائية من كل حالة في كل 10 ملليلتر aliquots الفردية من ثقافة جديدة المتوسطة. ثم بذور الخلايا في اثنين من 35 ملليمتر الأطباق الثقافة لكل حالة ووضع الخلايا في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاثة أيام. قبل خمس إلى ست ساعات من تحليل الخلية في الوقت الحقيقي، ضع نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي في حاضنة ثقافة الخلية.

لإعداد فحص الغزو، واستخدام الأنابيب العكسية لوضع 50 ميكرولترات من DMEM تكملها 0.1 ميكروغرام لكل ملليلتر من هلام مصفوفة خارج الخلية في كل بئر من الغرفة العليا من لوحة غزو الخلية. مباشرة بعد الطلاء، وإزالة 30 ميكرولترات من حل مصفوفة خارج الخلية من كل بئر ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع ساعات. لإعداد برنامج قياس المعاوقة، قبل ست ساعات من القياس، استبدل الوسيط في جميع ثقافات الخلايا الكهرولبية بمتوسط مصل منخفض.

ضمن علامة التبويب تخطيط في برنامج قياس المعاوقة المقترن، حدد آبار رباعية لكل حالة بيولوجية. ضمن علامة التبويب جدولة، قم بتعيين خطوة قياس خط الأساس لمرة واحدة بفاصل زمني مدته دقيقة واحدة، ثم قم بتعيين خطوة ثانية لقياس مقاومة الخلية في مهدات فردية ذات علاقة بالتجربة الفعلية. ساعة واحدة قبل بدء قياس مقاومة الخلية، إضافة 160 ميكرولترات المتوسطة تكمل مع مصل الأبقار الجنينية 10٪كما chemoattractant في آبار الغرفة السفلى من غزو الخلية ولوحة الهجرة.

لقياس الغزو، وتجميع الغرفة العليا التي تحتوي على مصفوفة هلام الآبار المغلفة خارج الخلية. لقياس الترحيل، استخدم الآبار غير المصقولة في الغرفة العليا. لأي نوع من التجارب، ملء الآبار في الغرفة العليا مع 50 ميكرولترات من المتوسط المصل منخفضة ووضع الغرف في مهد النظام.

انقر فوق علامة التبويب رسالة في البرنامج لتحديد ما إذا كان يتم التعرف على كافة الآبار من قبل وحدة التحكم. إذا كانت الرسالة تعرض كما هو متوقع، فإن اللوحة في الحامل جاهزة للتجربة. ثم ضع لوحات معبأة تماما في حاضنة ثقافة الخلية في الوقت الحقيقي خلية تحليل نظام مهد لمدة ساعة واحدة لتأقلم لوحة لظروف ثقافة الخلية.

في حين أن لوحات هي التوازن، حصاد خلايا الورم الأرومي الدبقي كما أظهرت وإعادة تعليق الخلايا من كل حالة في ثماني مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 800 ميكرولترات من تركيز متوسط منخفض في المصل. بالإضافة إلى ذلك، جانبا ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في مليلترين من الثقافة المتوسطة لبذر في طبق 35 ملليمتر لتحليل لطخة الغربية المصب. لقياس قراءة ما قبل الترحيل الأساسي، في نهاية عملية التأقلم، انقر فوق الزر "بداية المهد".

وبعد الحصول على القياس الأساسي، يتم نقل ألواح الهجرة والغزو من مهد كل منها إلى خزانة للسلامة الأحيائية. عكس ماصة 100 ميكرولتردات من الخلايا في آبار غرفة أعلى رباعية لكل حالة بيولوجية في البئر المناسب لغزو الخلايا ولوحات الهجرة كما هو مبرمج في وحدة التحكم في المهد. بعد البذر، والحفاظ على لوحات في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا لتسوية بالتساوي على أسفل لوحة قبل نقل لوحات إلى مهد كل منها.

انقر فوق الزر "بدء" لبدء قياس مقاومة الخلية. لتصور التغييرات في مقاومة الخلية كفهرس الخلية بطريقة تعتمد على الوقت أثناء أو بعد إكمال التجربة، افتح علامة التبويب تحليل البيانات. لتصور البيانات لكل من الشروط المعنية إما بشكل فردي أو كمتوسطات و/أو انحرافات معيارية، انقر فوق مربعات الخيارات للانحراف المعياري والمتوسط.

لتصدير بيانات فهرس الخلايا إلى ملف جدول بيانات، ضع المؤشر في منتصف إطار تحليل البيانات وانقر بزر الماوس الأيمن. في مربع الحوار الذي يظهر، حدد خيار نسخ البيانات في تنسيق القائمة ولصق البيانات في جدول بيانات مفتوح. لتحرير التجربة، انقر على الزر Release في كل cradle.

بروتين CRK محول الضربة القاضية يقلل Crk1 وCrk2 مستويات البروتين بنسبة 85٪ و 86٪ على التوالي دون تحفيز مستويات البروتين Crk مثل. الضربة القاضية من Crk مثل يقلل من التعبير عن البروتين CRK مثل بنسبة 85٪ مع تخفيضات طفيفة في مستويات البروتين Crk1 وCrk2. الجمع بين كل siRNAs يقلل Crk1، Crk2، والتعبير الشبيهة Crk بأكثر من 80٪، في حين لا يتأثر Vinculin ولا ألفا توبولين التعبير من قبل أي مزيج من Crk أو Crk- مثل الضربة القاضية.

خلايا الورم الأرومي الدبقي في الدماغ البشرية تهاجر على طول التدرج استجابة لتركيزات مصل عالية تصل إلى الحد الأقصى لمستوى الهجرة في 13 ساعة. في خلايا الضربة القاضية Crk، على الرغم من أن الترحيل في البداية تأخر، استمرت الخلايا في الهجرة حتى 23 ساعة. Crk مثل الضربة القاضية يقلل إلى حد كبير من الهجرة الخلية مع خط الخلية الأرومية الدبقية تفقد تماما قدرتها على الهجرة على الضربة القاضية من كل من Crk وCrk مثل مما يشير إلى أن Crk وCRK مثل تلعب أدوارا تداخلا أساسيا في الهجرة خلية السرطان.

ومع ذلك ، عندما يتم رصد غزو الخلايا على مدى عدة أيام ، تصل خلايا Crk الضربة القاضية إلى مستوى أقصى مماثل من غزو الخلايا مقارنة بالسيطرة على خلايا الورم الأرومي الدبقي في 60 ساعة مع الخلايا الشبيهة بالخلايا Crk التي تستعيد قدرتها الغازية جزئيًا بمقدار 90 ساعة وخلايا Crk-Crk المزدوجة مما يدل على انخفاض القدرة على الغزو بعد 40 ساعة. وتؤيد النتائج بوضوح الاقتراح القائل بضرورة تحليل غزو الخلايا طوال فترة التجربة بأكملها. البذر العدد الصحيح من الخلايا وتجنب فقاعات الهواء أثناء تسجيل مصفوفة خارج الخلية للغزو خلايا القياس وبذر هي النقاط الرئيسية لنجاح هذه التجربة.

وبعد إجراء مماثل ولكن باستخدام لوحات الإلكترونية، يمكن تحديد التصاق الخلية و حركيات انتشار الخلايا.