قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans

هنا ، نحن نميز استجابات الإجهاد البرودوسلي الخلوي في النيماتودا C. elegans من خلال قياس تنشيط المراسلين النسخ الفلوريو وحساسية الإجهاد الفسيولوجي.

ويمكن استخدام هذه الطرق لتوصيف استجابات الإجهاد في C.elegans وتحديد ما إذا كانت الاضطرابات الوراثية أو الدوائية تؤثر على تنشيط الممرات الخلوية الواقية. هذه الطرق تسمح بإجراء اختبارات سريعة وعالية الإنتاجية لمئات الانزعاجات مثل الانزعاج الجيني على المستويين الجزيئي والفسيولوجي. لضمان إجراء الفحص بشكل صحيح، وتشمل الضوابط الإيجابية والسلبية.

مزامنة الحيوانات الصحية التي تتغذى جيدا على المرحلة المناسبة واستخدام لوحات جديدة للتجربة. التصور من micromanipulation من الديدان مع اختيار يمكن أن تساعد المستخدمين الجدد على فهم كيف يمكن اصطفا ديدان وتقييمها لقابلية البقاء. إثبات الإجراءات سيكون فرانكينو، هولي غيلديا، وميليسا ميتكالف، طلاب الدراسات العليا في مختبرنا.

لاستخدام الحيوانات التي تعبر عن GFP تحت المروج للبروتين صدمة الحرارة أربعة لتفعيل reticulum endoplasmic كشف استجابة البروتين، وتنمو الحيوانات مراسل متزامنة في 20 درجة مئوية حتى مرحلة L4 وغسل الديدان قبالة لوحة باستخدام M9 المتوسطة ونقلها إلى أنبوب. بعد جمع الديدان عن طريق الطرد المركزي، استبدال M9 مع 25 نانوغرام لكل ملليلتر من المخدرات ذات الأهمية في M9 أو ثنائي الميثيل سلفوكسيد في M9 في أنابيب الحيوان التحكم. ثم ضع الديدان على منصة دوارة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات عند 20 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة، الطرد المركزي الديدان لتسوية قبل استبدال محلول المعالجة مع 15 ملليلتر من M9 وحدها. بعد غسل اثنين، نقل الحيوانات إلى لوحات NGM أو لوحات تدخل الحمض النووي الريبي NGM حسب الاقتضاء والسماح للدودة لاسترداد بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية. عندما تعافى الديدان، إضافة خمسة إلى 10 ميكرولترات من 100 ملليمولار الصوديوم أزيميد على لوحة NGM القياسية دون البكتيريا ووضع لوحة من الديدان تحت مجهر تشريح.

نقل 10 إلى 20 الحيوانات من لوحة في بقعة من أزيد الصوديوم. وينبغي أن الحيوانات الاستيلاء على الحركة بعد وقت قصير من الهبوط في محلول الملح. مرة واحدة قد تبخرت azide الصوديوم، يصطف الحيوانات في الإعداد التصوير المطلوب مع الجانبين الأمامي والخلفي في نفس التوجه لجميع الحيوانات ووضع على الفور لوحة من الحيوانات تحت مجهر ستيريو.

إطلاق برنامج التصوير المجهر ستيريو وتحت علامة التبويب المقتنيات، انقر فوق فتح المشاريع والمجلد لفتح مشروع جديد. انقر بزر الماوس الأيمن ثم حدد إعادة تسمية لإعادة تسمية المجلد. ضع عينة الفيروس المتنقل تحت هدف المجهر واستخدم الإعداد Brightfield لتحديد موقع النقطة المحورية الصحيحة للدود لتقليل تبييض الفلورسنت.

وسيكون مركز العينة النقطة التي يكون فيها خط البيض مرئيًا بوضوح وليس غامضًا. حدد وقت التعرض للتأكد من عدم تشبع البيكسلات وكذلك لضمان أن الإشارة أعلى من حد الكشف. بعد تعيين وقت التعرض والتكبير و التركيز و مكثفات Brightfield إلى الإعدادات المناسبة، انقر فوق زر التقاط الصورة للحصول على صورة.

للتصوير باستخدام مجهر نطاق واسع مركب، ضع لوحة معالجة التحكم الأساسية على مرحلة المجهر واسعة المجال المركبة واستخدم لوحة اللمس لإطلاق برنامج التحكم. إنشاء ألبوم جديد واسم الملف ووضع لوحة تحت عدسة الهدف. استخدم التحكم الأساسي ولوحات التحكم الإيجابية لضبط وقت التعرض وشدة الفلورنس بحيث تكون الإشارة مرئية ولكنها غير مشبعة.

ثم احفظ صور Brightfield و GFP FITC. لتحديد كمي التعريفي للمراسل بواسطة الجسيمات الكبيرة تدفق القياس، أولا بدوره على الليزر cytometer وفتح برنامج مقياس الجُل. انقر فوق بدء تشغيل الليزر في نافذة البرنامج وانقر فوق تشغيل لبدء الليزر في إطار التحكم بالليزر الأرجون.

عندما يصل الليزر إلى حوالي 12 مللي واط ويصل مستوى مصدر الضوء 488 إلى حوالي 12 ، انقر فوق done والتحقق من قيم الضغط الأربعة. إذا كانت القيم تبدو مشابهة لتلك التي تمت ملاحظتها في الإعداد الأصلي، فتحقق من مربع موافق الضغط. المقبل، للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء أو الحطام عرقلة تدفق اأشاء وعينة من خلال خلية تدفق، انقر فوق تنظيف عدة مرات.

ثم إيقاف تشغيل الفرز وعلى اطفئ على إعادة تشغيل تدفق. للتحقق من معدل التدفق، جمع اجمد لمدة 60 ثانية. جمع اغرم في أنبوب 15 ملليلتر لمدة 60 ثانية.

وينبغي أن يكون معدل التدفق من 9 إلى 10 ملليلتر في الدقيقة. لتشغيل العينات، قم بضبط طاقة المضاعفة الضوئية بالليزر إلى مستوى عالٍ بما يكفي بحيث تكون الإشارة أعلى من حد الكشف ولكن ليس أعلى من حد التشبع. أداء حجم الغات لاستبعاد فقاعات، والحطام، والبيض، وغيرها من الجزيئات الصغيرة غير المرغوب فيها، وتشمل فقط الحيوانات ذات الأهمية مثل البالغين.

عندما تم تعيين المعلمات الفرز، إضافة الديدان المعدة إلى كوب وانقر فوق الحصول على. ووتش للتأكد من أن كل من السائل لا يتم تناولها في الجهاز لأن هذا سوف يسبب تدفق مقياس الهواء لاتخاذ في الهواء وخلق فقاعات داخل كاشف. عندما تكون العينة منخفضة و / أو ما يكفي من الحيوانات قد تم جمعها، انقر فوق إيقاف.

لتخزين البيانات المُسورة استناداً إلى قيود الحجم فقط، انقر فوق الإعداد، تخزين البيانات، فقط مسور، ومخزن مسور لحفظ البيانات. ثم شطف كوب جمع مع المياه الأيونية وإزالة الغسيل عن طريق الفراغ ثلاث مرات قبل تكرار التحليل مع العينة التالية. لقياس حساسية الاجهاد الميتوكوندريا والأكسدة، إضافة 50 إلى 75 ميكرولترات من الباراكوات في M9 إلى 8 إلى 10 آبار لكل حالة من لوحة مسطحة أسفل 96 جيدا ونقل ثمانية إلى 10 الديدان لكل حالة إلى كل بئر من الباراكوات.

كل ساعتين، اضغط على لوحة بلطف للتسبب في الحيوانات الحية لسحق أو الانحناء للسماح بتسجيل عدد من الحيوانات النافقة في البئر. لقياس حساسية درجة حرارة الحيوانات، احتضان الديدان لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام في 20 درجة مئوية قبل الطلاء 10 إلى 15 الحيوانات لكل صفيحة لكل حالة ما مجموعه أربعة إلى ستة لوحات. ثم ضع اللوحات في حاضنة درجة 34 أو 37 درجة مئوية وسجل بقاء الدودة كل ساعتين كما هو موضح للتو.

مراسل Hsp-4 لديه انطباع القاعدي الحد الأدنى في غياب الإجهاد ولكن معارض تعبير GFP قوية عندما تتعرض الحيوانات للإجهاد إندوبلاسميكي ريكولوم باستخدام المخدرات Tunicamycin. ويمكن أيضا أن تكون هذه الاختلافات كميا باستخدام مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تحريض transgene تحت الإجهاد التشنجي endoplasmic supressed تماما بالضربة القاضية من XBP-1 عن طريق تدخل الجيش الملكي النيبالي.

ويمكن إجراء عمليات قياس مماثلة لقياس الإجهاد الميتوكوندريا، والإجهاد التأسدي، والإجهاد الحراري. يمكن أيضًا قياس الاستجابات الفسيولوجية الحيوانية الكاملة للإجهاد باستخدام العديد من مقايسات البقاء على قيد الحياة. على سبيل المثال، يتم استخدام التعرض لTunicamycin لقياس حساسية الإجهاد التشنجية.

يؤدي الضربة القاضية لجين XBP-1 إلى زيادة كبيرة في الحساسية تجاه تونيكاميسين. وعلاوة على ذلك، يستخدم التعرض للعامل الكيميائي Paraquat لقياس حساسية الإجهاد التأسدي والميتوكوندريا. ينتج عن النافلة للجين DAF-2 زيادة كبيرة في مقاومة Paraquat.

يمكن قياس الحرارة عن طريق تحديد بقاء الحيوانات في درجات حرارة مرتفعة ويمكن رسمها كنحن للبقاء على قيد الحياة. وينبغي أن يتم تنفيذ هذه المقايسات ما لا يقل عن أربع إلى ست مرات وجميع النسخ المتماثلات ينبغي أن تكون تآمر ضد بعضها البعض كما يدل على تقلب الحرارة عالية بشكل لا يصدق بالمقارنة مع غيرها من المقايسات الإجهاد. عند تصوير الحيوانات، من المهم تعيين المعلمات بحيث لا يكون هناك أكثر من أو تحت تشبع الإشارة وضمان استخدام نفس المعلمات طوال التجربة.

بروتوكولات التصوير المذكورة هنا قابلة للفحص على نطاق واسع بما في ذلك الشاشات على نطاق الجينوم وهي كبيرة لكل من الدراسات الاستكشافية والتأكيدية التي يمكن بعد ذلك متابعتها من قبل الاختبارات الفسيولوجية الموصوفة.