عزل Myofibrils من خزعات العضلات والهيكل العظمي وتحديد وظيفة المتعاقدة مع نانو نيوتن القرار نقل الطاقة

قدم هنا هو بروتوكول لتقييم خصائص العقد من myofibrils العضلات المتصدع مع قرار نانو نيوتن. يستخدم البروتوكول إعدادًا باستخدام مسبار قوة بصري قائم على التداخل. هذا الإعداد يولد البيانات مع نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء وتمكن من تقييم الحركية العقدية من myofibrils.

تقييم خصائص العقد من myofibrils معزولة عن العضلات المئمّلة يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان خلل ساركومير هو السبب الرئيسي لضعف العضلات بسبب الطفرات في البروتينات الساركية. ويمكن استخدام هذه التقنية للحصول على بيانات مع نسبة إشارة عالية جدا إلى الضوضاء مع دقة نانوتون. هذا البروتوكول هو أيضا مناسبة لقياس قابلية في cardiomyocytes permeabilized.

نضع في اعتبارنا أن محول القوة هشة جدا. حتى عند إزالة الغراء من إبرة تصاعد أو عند لصق myofibril، تحتاج إلى أن يكون اليد ثابتة، والكثير من الممارسة، والكثير من الصبر. قبل تركيب الأنسجة، ضع قضيبًا متجانسًا في الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة العضلية.

الحفاظ على أنبوب على الجليد، تدور الدوار لمدة 15 ثانية على سرعة خمسة. في نهاية التجانس، ونقل 50 ميكرولترات من تعليق myofibril الناتجة و 250 ميكرولترات من حل الاسترخاء على شريحة مغلفة بولي HEMA في حمام الأنسجة. تغطية الحمام مع غطاء لحماية الخليط من الغبار والانتظار 5 إلى 10 دقائق للسماح myofibrils لغرق إلى الجزء السفلي من قطرة.

أثناء غرق myofibrils ، قم بتهوية Shellac الغراء الإيثانول في 65 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 ثانية قبل إضافة حوالي ستة ميكرولترات من الغراء على شريحة زجاجية غير المصقولة. تراجع مرارا وتكرارا غيض من كل إبرة تصاعد في الغراء حتى طبقة من الغراء مرئية. ثم استخدام المتلاعبين الصغيرة لنقل التحقيق وبيزو عموديا لإفساح المجال لحمام الأنسجة على مرحلة المجهر وإزالة الشريحة الزجاجية التي تحتوي على الغراء.

بعد تركيب myofibrils، لقياس طول السارومير، نقل بيزو و / أو قوة التحقيق لتعيين طول الساركوميري الأولي من myofibril إلى 2.5 ميكرومتر. باستخدام وظيفة السفينة من برنامج تحكم النظام، وقياس طول myofibril والعرض. استخدام مرحلة المجهر لوضع myofibril في وسط صورة الفيديو وتمتد مستطيل من جانب واحد من myofibril إلى الآخر، مع الحرص على إدراج الحافة الداكنة من قطرات الغراء.

لبدء تسجيل البيانات، انقر فوق بدء. بعد خمس ثوان، انقر فوق إيقاف مؤقت. سيكون طول قد تم تسجيله.

لقياس العرض، قم بتدوير الكاميرا 90 درجة لعرض تباين حافة myofibril نفسه. ضبط المستطيل وانقر فوق ابدأ لبدء تسجيل البيانات. بعد خمس ثوان، انقر فوق إيقاف مؤقت.

سيتم تسجيل العرض. لوضع الزجاج ثيتا، استخدم العدسة والمتلاعب لتحريك بعناية الزجاج ثيتا نحو myofibril. محاذاة القناة العليا من الزجاج ثيتا مع myofibril وتنفيذ خطوة سريعة للتحقق من الموقف.

بدوره على تدفق الاسترخاء الخلفية للتحقق من محاذاة الزجاج ثيتا واستخدام ذراع صمام Luer لتشغيل تدفق غرفة التدفق. ثم لبدء استنزاف غرفة تدفق ومنع تفيض من غرفة تدفق، تعيين صمام مضخة تدفق إلى صمام حمام اثنين، ووضع خطوة صغيرة إلى الصغر، والهدف المكبس إلى 48، 000، وسرعة المكبس إلى 38 إلى 40. لقياس معدل إعادة تطوير التوتر، حساب حركة بيزو اللازمة لتراخي myofibril بنسبة 15٪، وأدخل هذه القيمة في مولد إشارة.

انقر فوق استئناف لمواصلة تسجيل البيانات والصمامات المفتوحة واحد وستة لبدء تدفقات حل الاسترخاء وتركيزات الكالسيوم المختلفة من خلال الزجاج ثيتا على التوالي. حدد نطاق إعادة التعيين على مقياس التداخل لإعادة تعيين نطاق مقياس التداخل بحيث تكون قوة الأساس صفر فولت. عندما يكون تتبع القوة ثابتًا، قم بتنفيذ الخطوة السريعة للزجاج ثيتا بحجم خطوة 100 ميكرومتر.

عندما يتم التوصل إلى هضبة القوة، تنفيذ تقصير إعادة تمتد مع بيزو. سيتم تسجيل تتبع الاسترخاء التنشيط. انقر فوق إيقاف مؤقت.

لتنفيذ امتداد خطوة من الحكمة، انقر فوق بدء وإعادة تعيين نطاق مقياس التداخل بحيث تكون قوة الأساس صفر فولت. تنفيذ خطوة الحكمة تمتد مع مولد إشارة. عند الانتهاء من تمتد، واستخدام بيزو لتقصير myofibril إلى طول الركود.

ثم اضغط على إيقاف مؤقت وإيقاف وحفظ البيانات. هنا، تظهر آثار قوة تجربة قوة نشطة مع myofibril معزولة عن العضلات الرباعية البشرية السليمة. تم تنشيط myofibril خمس مرات مع حلول مع تركيزات الكالسيوم متفاوتة، مع قوة قصوى متوسطة من كل من myofibrils من حوالي 123 millinewtons لكل ملليمتر مربع.

يتيح بناء قوة منحنى تركيز الكالسيوم من الهضبة التي تم الوصول إليها خلال كل عملية تنشيط في كل من منحنيات الكالسيوم الخمسة حساب تركيز الكالسيوم بنسبة 50٪ من إنتاج القوة القصوى. كما هو موضح في هذا التحليل التمثيلي، يمكن معالجة الميوفيبيلات بمركبات متعددة في تجربة واحدة للإجابة على أسئلة إضافية حول نوع الميوفيريبريل. ويمكن أيضا قياس القوة النشطة وطول الساركومير للسماح بحساب معدلات إعادة التطوير والتنشيط والاسترخاء.

الارتفاع الحاد المبين في المربع الأحمر المنقط سببه كل من اللزوجة والمرونة. الهضبة لا تشبه سوى عنصر مرن. كما اللزوجة يقاوم سلالة خطيا، انخفضت القوة بعد إزالة سلالة.

عند وضع الزجاج ثيتا، تأكد من محاذاته بشكل صحيح مع myofibril. وإلا، فإن الحل تفعيل قد تأتي بين الألياف البصرية و cantilever من التحقيق قوة وهذا يؤدي إلى حدوث القطع الأثرية في البيانات الخاصة بك. أيضا، قد لا تنشيط myofibril بشكل صحيح.

هذا الأسلوب من perfusion هو أيضا مناسبة لتحديد نوع الألياف العضلية من myofibril. على سبيل المثال، يمكنك أولاً اضماب myofibril مع حل الكالسيوم العادي تليها ضخ من نفس الحل، ولكن بعد ذلك إضافة العضلات الألياف نوع محددة قوة تعزيز المركب.