توصيف هياكل أميلويد في الشيخوخة C. Elegans باستخدام التصوير مدى الحياة فلورسينس
March 27th, 2020
الفلورسينس مدى الحياة وشاشات التصوير، والقياس الكمي ويميز الميول التجميع من البروتينات في المعيشة، والشيخوخة، وشدد نماذج مرض C. elegans.
الطريقة تسمح لنا أن نميز بوضوح التكامل بنيات بروتين اميلويد من النظراء القابلة للذوبان والمتراكمة حتى. يتم تنفيذ هذه التقنية في الجسم الحي بطريقة غير باضعة مع القليل أو لا آثار جانبية سامة. كما أنه يعتمد على خصائص الفلورسنت من الفلوروفور نفسه، فهي قوية للغاية وقابلة للتكرار مع مرور الوقت.
وقد استخدمت FLIM في مجال تشخيص السرطان. ومع ذلك، فإننا نستخدمها لدراسة الآليات الأساسية لتجميع البروتين والتي هي في الواقع ذات الصلة للأمراض العصبية. ويمكن استخدام المنهجية في مجال تجميع البروتينات.
طالما يتم وضع علامة على البروتين المرتبط بالمرض بمسبار فلوري ، يمكن تتبعه ومراقبته بمرور الوقت. ويمكن دراسة المركبات والاستراتيجيات التي تعزز أو تمنع التجميع بنجاح. أي نظام بيولوجي يسمح بأن يكون مرئياً عن طريق المجهر الضوئي هو مناسب ل FLIM إما في الجسم الحي أو السابقين في الجسم الحي ، على سبيل المثال في زراعة الخلية ، في عينات مثبّتة أو مثبّتة وفي أي وسيلة ضرورية.
تأكد من اختبار خصائص الفلوروفور المحدد داخل النياتودا قبل الحصول على بيانات تجريبية واختبار أن الإعداد يعمل بكامل طاقته قبل الحصول على القياسات. لبدء، وتنمو والحفاظ على الديدان الخيطية في 20 درجة مئوية على لوحات NGM. سن الديدان الخيطية حتى اليوم الرابع من الحياة كبالغين صغار واليوم الثامن من الحياة كبالغين كبار السن.
في يوم التصوير، ابدأ بإعداد شرائح التصوير. مكان agarose ومزدوجة الماء المقطر بتركيز 3٪ الوزن من حيث الحجم. نقله إلى ميكروويف لتذوب ثم ندعه يبرد قليلا.
قطع غيض من ماصة ملليلتر واحد واتخاذ ما يقرب من 200 ميكرولترات من agarose ذاب. الماصات agarose على شريحة زجاجية نظيفة ووضع على الفور ثانية واحدة على رأس تجنب تشكيل أي فقاعات. اترك الشرائح لتجف وأزل الشريحة الزجاجية العلوية برفق.
والنتيجة هي شريحة زجاجية مع سطح agarose حتى حيث سيتم وضع الديدان الخيطية. مرة واحدة في إعداد التصوير جاهز للاستخدام، والعمل تحت مجهر ستيريو، ووضع قطرة 10 ميكرولتر من مجمع مخدر على وسادة agarose ونقل بلطف خمسة إلى 10 الديدان الخيطية في ذلك. استخدم طرف رمش لفصل الديدان الخيطية.
الاحتفاظ بها قريبة من بعضها البعض ولكن لا تلمس للسماح لتسهيل توطين الديدان الخيطية أثناء الحصول على صورة. تراكب بعناية النيماتودا مع غطاء. في غضون ساعة واحدة بعد تركيب، واتخاذ القياسات.
تأكد من أن الديدان الخيطية غير متحركة تماماً. افتح برنامج اقتناء FLIM. حدد موقع زر علامة التبويب واضغط على مخرجات تمكين.
ضع الشريحة مع C.elegans المركبة على المسرح واستخدام عدسة تكبير 10X في وضع الإرسال ، قم بتعريب موضع النيماتودا على الشريحة. قم بإزالة الشريحة، والتبديل بين الهدف إلى عدسة تكبير 63X، وتطبيق وسيط الغمر المطلوب. ضع الشريحة على المسرح وتوطين الديدان الخيطية.
ابدأ في مسح العينة. حدد منطقة ذات أهمية وركز على مستوى الإسقاط الأقصى. على واجهة برنامج FLIM، معاينة عدد الفوتونات التي تم الكشف عنها.
يجب أن تكون قيمة ADC بين واحد مرات 10 إلى الرابع و واحد مرات 10 إلى الخامس. إذا لزم الأمر، قم بتحويل التركيز على مستوى مختلف أو زيادة قوة الليزر لجمع المزيد من الفوتونات. تأكد من تجنب تراكم الفوتون ولكن جمع كمية كافية من الفوتونات لخلق تناسب حياة جيدة والقياس.
في شريط القوائم، حدد علامة التبويب لتعيين معلمات الامتلاك. حدد مزامنة المسح الضوئي في للسماح للكشف عن الفوتون واحد. تعيين الامتلاك إلى مقدار محدد من الوقت أو عدد ثابت من الفوتونات.
اضغط على البدء في الحصول على. فتح البرنامج واستيراد ملفات البيانات FLIM عن طريق ملف، تحميل البيانات FLIM. تحميل جميع العينات من شرط واحد حتى لو تم الحصول عليها في جلسات مختلفة ومن تكرارات بيولوجية مختلفة.
إذا لزم الأمر، مقطع إلى إشارة nematode لكثير من FLIM صورة عبر تجزئة، مدير التجزئة. اسحب أداة الاقتصاص حول المنطقة التي تهمك حتى يتم تمييزها. بعد الانتهاء، اضغط موافق. حدد منطقة صغيرة حيث تظهر الصورة المستندة إلى الكثافة لـ C.elegans.
يظهر منحنى الاضمحلال في تلك المنطقة في نافذة الاضمحلال الكبيرة على الجانب الأيمن من الواجهة. لاستقراء العمر، في علامة التبويب البيانات، تعيين قيمة دنيا متكاملة عشوائية بين 40 إلى 300 لاستبعاد أي بكسل خافت جداً لإنتاج ملائمة جيدة. حدد الحد الأدنى للوقت و الحد الأقصى للوقت للحد من إشارة FLIM إلى هذه القيم.
لا تقم بتغيير عدد الفوتونات المسبقة من واحد. إدخال معدل التكرار في ميغاهرتز من الليزر المستخدمة أثناء الاستحواذ. إدخال قيمة الحد الأقصى لبوابة لاستبعاد كافة وحدات البكسل المشبعة.
في علامة التبويب العمر، حدد ملائمة عمومية ليتم استخدامها. لا تقم بتغيير أي معلمة أخرى باستثناء عدد التحديد الأسي إذا كان من المعروف أن اضمحلال الفلورسينسي المختار متعدد الأسية ويعرض أكثر من عمر واحد. قم بتحميل IRF عبر قائمة IRF.
لتقدير التحول IRF، حدد IRF، تقدير التحول IRF. تظهر مجموعة من القيم تلقائياً في علامة التبويب IRF. بمجرد تأسيس هذا، لا تقم بتغيير أي معلمات أخرى من علامة التبويب هذه.
بمجرد تعيين كافة المعلمات، اضغط على مجموعة بيانات ملائمة. يجب أن تتداخل الملاءمة الناتجة المميزة في خط أزرق مع كافة الأحداث. يتم الحصول على تناسب جيد عندما يتم محاذاة كافة الأحداث على طول تناسب.
انقر فوق علامة التبويب المعلمات الموجودة في القوائم اليمنى العليا من واجهة البرنامج وحدد إحصائية، المتوسط المرجح، وتحقق من أن قيمة مربع تشي أقرب ما يمكن إلى واحد. وبالتالي فإن قيمة العمر للصورة المختارة يتم الكشف عنها باعتبارها تاو واحد. تصدير أي معلومات ذات أهمية من خلال ملف، وتصدير الصور كثافة، تناسب نتيجة الجدول، والصور، المدرجات.
يتم عرض الخرائط التمثيلية لـ C.elegans التي تعبر عن Q40 المرابع العضلية في اليوم الرابع أو اليوم الثامن من الحياة هنا. كان امتداد Q أطول من IQ85 أكثر عرضة للتجميع وعرض تحول مدى الحياة fluorescence في الرسم البياني بالفعل في اليوم الرابع من الحياة. في الواقع، في اليوم الرابع، لوحظ تشكيل بؤر ل IQ85 بينما لا يزال غائبا في IQ44.
عند الشيخوخة، ومع ذلك، IQ44 عرضت أيضا تشكيل بؤر وبالتالي عمر الفلورانس مخفض. وأخيراً، لم يتم الكشف عن تكوين البؤر ولم ينخفض عمر الفلورانس في سلالة NQ40CFP. لهذه السلالة، كانت هناك فقط تغييرات خفية غير هامة لمدى حياة الفلورانس المتوسط عند الشيخوخة.
بمجرد تأسيس نموذج النيماتودا، فإن كمية الفوتون التي يتم جمعها هي الأهم للحصول على تناسب حياة جيدة. ويمكن أن يكون الأسلوب الملتصقة أكثر مع تقنيات مختلفة مثل فورستر الرنين نقل الطاقة، فريت، انتعاش الفلوريسين بعد photobleaching، FRAP، أو القياس. كل هذه التعديلات توفر معلومات إضافية عن خصائص الدراسات البروتينية وشكلها المجمع.
وضمن مجال تجميع البروتينات وداء البروتين، سمحت هذه التقنية بالتحقيق في أي انزعاج مفروض على النظام، وتوزيع أنواع بروتينية مختلفة، والاتجار بها، وبشكل عام الاختلاف وأهمية كسور البروتين القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان داخل الكائن الحي. azide الصوديوم مخدر سامة وينبغي التعامل معها مع قفازات ونظارات واقية وتخفيفها تحت غطاء الدخان. ولأن هذه التقنية تعتمد على المجهر، فمن المهم اتباع جميع التحذيرات المتعلقة بالعمل باستخدام الليزر.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تستخدم هذه الدراسة التصوير بعمر التفلورسنت (FLIM) لمراقبة وتقييم تراكم البروتين في نماذج C. elegans الحية. تسمح هذه التقنية بالملاحظة غير الغازية للهياكل البروتينية ذات الصلة بالأمراض التنكسية العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- تراكم البروتين هو سمة رئيسية في الأمراض التنكسية العصبية.
- FLIM يوفر طريقة لتمييز بين حالات البروتين المختلفة.
- يتم تنفيذ التقنية في الجسم الحي مع سمية قليلة.
- FLIM له تطبيقات خارج علم الأعصاب، بما في ذلك تشخيص السرطان.
هدف الدراسة
- للتحقيق في آليات تراكم البروتين.
- لتمييز بين هياكل الأميلويد المتكاملة والبروتينات الذائبة.
- لتطبيق FLIM في سياق الشيخوخة والإجهاد في نماذج C. elegans.
الطرق المستخدمة
- التصوير بعمر التفلورسنت (FLIM)
- التصوير في الجسم الحي لـ C. elegans
- تقنيات الملاحظة غير الغازية
- تحليل ديناميكيات تراكم البروتين
النتائج الرئيسية
- التمييز الناجح بين هياكل البروتين العائلويدية من نظائرها الذائبة.
- ثبتت متانته وتكراره لـ FLIM مع مرور الوقت.
- أبرزت أهمية تراكم البروتين للأمراض التنكسية العصبية.
- أظهرت آثار جانبية سامة قليلة جدًا لتقنية التصوير.
الاستنتاجات
- FLIM هو أداة قيّمة لدراسة تراكم البروتين في الكائنات الحية.
- يمكن أن تعزز الطريقة فهم آليات الأمراض التنكسية العصبية.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى مجالات أخرى، بما في ذلك أبحاث السرطان.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Fluorescence lifetime imaging (FLIM) enables noninvasive, quantitative monitoring of amyloid fibrilization in living models, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs. By distinguishing integrated amyloid structures from soluble species without staining, FLIM provides predictive confidence in early discovery workflows. The method’s robustness and reproducibility facilitate cross-functional collaboration and scalable assay development for protein homeostasis research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing amyloid fibrils from soluble and accumulated protein species in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, fluorescence-lifetime-based readouts that correlate directly with aggregation levels.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by allowing comparison of fibrilization across genetic backgrounds, environmental stimuli, or amyloid variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling label-free, longitudinal tracking of protein aggregation in specific cells such as neurons.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through FLIM’s independence from fluorophore expression levels and resistance to photobleaching.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by detecting aggregation-promoting or -preventing strategies in any light-microscopy-compatible biological system.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by monitoring aggregation dynamics across aging and proteostasis network perturbations in disease-relevant models.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by quantifying soluble versus insoluble protein fractions in living organisms over time.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when studying protein homeostasis, enabling comparison of trafficking and distribution of protein species without further staining.
Pipeline & Workflow Integration
FLIM integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies by providing quantitative, noninvasive readouts of protein aggregation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of amyloid structures in specific cells such as neurons during aging.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through photon collection and lifetime fitting that exclude dim pixels and saturated signals for robust measurements.
- Analytics: Provides statistical outputs such as chi-square values near one and weighted mean lifetime (tau one) to compare conditions and assess fit quality.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling observation of aggregation in aging models and upon proteostasis network perturbation, relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for comparing fibrilization across different amyloid proteins, genetic backgrounds, or environmental stimuli in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein aggregation studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of amyloid detection in vivo without staining or bleaching.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early detection of aggregation propensity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, longitudinal aggregation data in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence lifetime imaging and laser safety protocols.
- Needs FLIM-capable microscopy setup with appropriate objectives (e.g., 63X immersion) and photon detection capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters such as scan sync, repetition rate, gate max, and photon collection thresholds (10⁴–10⁵ ADC).
- Involves adaptation considerations across model systems, including agarose pad preparation, anesthetic use (e.g., sodium azide), and immobilization protocols.
- Includes practical limitations such as the need to pre-test fluorophore properties in the nematode model and avoid photon pileup during acquisition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:25
Synchronization of C. elegans and Mounting Nematodes onto Microscopy Slides
2:58
Acquisition of FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) Data
4:32
Analysis of FLIM Data Using FLIMfit Software
7:15
Results: Fluorescence Lifetimes
8:15
Conclusion
![تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56279.jpg%3Fv%3D2026-07-04T00%253A28%253A46.000Z&w=384&q=75)
