فحص Phytoestrogens باستخدام مستقبلات الاستروجين القائم على الخلية β مراسل Assay

نستخدم هذا الاختبار لتقييم ما إذا كانت الأطعمة النباتية تحتوي على نباتات نباتية ، والتي يمكن أن تؤثر على العمليات الفسيولوجية في ، وكذلك السلوك والنجاح الإنجابي. يوفر هذا الاختبار طريقة بسيطة وموثوقة لتحديد ما إذا كانت النباتات تنتج مركبات استروجين ذات نشاط بيولوجي. تم تطوير هذه الطريقة في البداية لفحص الأدوية ذات نشاط xenosterogen للتطبيقات في الطب.

على سبيل المثال ، تثبيط تكاثر الخلايا. نحن نستخدمه لتقديم نظرة ثاقبة لبيئة الرئيسيات وتطورها. من المهم أن تتدرب على العمل بتقنية التعقيم في بيئة نظيفة قبل محاولة هذا الفحص ، لأنه حساس جدا للتلوث.

ابدأ بتجفيف العناصر النباتية الطازجة بالتجميد باستخدام المجفف بالتجميد ، ثم قم بطحنها جيدا باستخدام مطحنة طحن بشاشة شبكية 0.85 ملم. قم بتخزين العينات المطحونة في أكياس في الظلام حتى الاستخراج. لاستخراج أي ستيرويدات نباتية محتملة في النباتات ، أضف عينة مجففة إلى قارورة ذات حجم مناسب ، ثم في الميثانول بدرجة HPLC.

قم بتغطية محلول الميثانول النباتي بورق الألمنيوم واضبطه على الدوران عند 100 دورة في الدقيقة لمدة ثلاثة أيام على شاكر مداري. بعد ثلاثة أيام ، استخدم ورق الترشيح لصب الطبقة الفوقية وفي نظام الترشيح بالتنقيط. جفف مستخلص النبات باستخدام مبخر دوار حتى يصبح سميكا ، ولكن يمكن سكره في قارورة سفلية مستديرة سعة 300 مل.

صب العينة في قارورة سعة 50 مل واشطف القارورة الكبيرة بكمية صغيرة من الميثانول ، ثم استمر في تجفيف العينة في القارورة الصغيرة حتى يتبخر الميثانول تماما. عند الانتهاء ، قم بوزن بقايا العينة بميزان تحليلي وسجل الكتلة. قم بإذابة المستخلص النباتي في DMSO بتركيز 0.1 جرام من المستخلص إلى ملليلترين من DMSO وقم بتدويته حتى يتجانس.

DMSO ليست سامة من تلقاء نفسها ، لكنها مركبة تسمح للمواد الأخرى بعبور الأغشية. نظرا لأننا لا نعرف ما إذا كانت نباتاتنا تحتوي على مواد كيميائية سامة ، يتم التعامل معها جميعا كما لو كانت خطرة. لا تسمح للمحلول بلمس الجلد ، واستبدل القفازات إذا كانت ملوثة ، وارتد أحذية سميكة ومعاطف مختبر.

قم بتخزين العينة على درجة حرارة أربع درجات مئوية في قوارير زجاجية كهرمانية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. قم بتدوير العينات ، ثم أضف أربعة ميكرولترات من كل عينة إلى 496 ميكرولتر من وسط الغربلة المركب للحصول على محلول DMSO بنسبة 0.8٪. قم بتطهير السطح الخارجي لأنبوب وسط استعادة الخلايا الدافئ مسبقا باستخدام 70٪ من الإيثانول وانقل 10 مل من الوسط إلى أنبوب من خلايا المراسل المجمدة لإذابتها.

أغلق أنبوب زنزانات المراسل وضعه في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق. بعد استرداد الخلايا من الحمام المائي ، اقلب الأنبوب برفق عدة مرات لتفتيت مجاميع الخلايا وإنتاج تعليق متجانس ، ثم قم بتنظيف سطح الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق خلية المراسل في كل بئر من صفيحة 96 بئر، ثم قم بتوزيع 100 ميكرولتر من العينات في ثلاث نسخ في الآبار المناسبة.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 22 إلى 24 ساعة. قبل نهاية حضانة اللوحة مباشرة ، قم بإزالة ركيزة الكشف ومخزن الكشف المؤقت من الثلاجة ووضعهما في منطقة إضاءة منخفضة حتى يوازنهما مع درجة حرارة الغرفة ، ثم اقلب كل أنبوب برفق لخلط المحاليل. مباشرة قبل اكتمال حضانة اللوحة ، اسكب محتويات مخزن الكشف بالكامل في أنبوب ركيزة الكشف لإنشاء كاشف الكشف عن اللوسيفيراز.

امزج الأنبوب برفق حتى لا ينتج رغوة. تخلص من محتويات لوحة العينة في حاوية نفايات غير مناسبة واضغط عليها برفق على منشفة ورقية نظيفة ماصة لإزالة القطرات الأخيرة من الآبار. أضف 100 ميكرولتر من كاشف الكشف عن اللوسيفيراز إلى كل بئر واترك لوحة الفحص ترتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، ثم حدد كمية التلألؤ باستخدام مقياس إضاءة لقراءة لوحة 96 جيدا.

تم فحص 22 مقتطفات من الفواكه والخضروات الموجودة بشكل شائع في الوجبات الغذائية البشرية لوجود مركبات الاستروجين. يتم تقديم النشاط الاستروجيني بطريقة نوعية ترتيبية عالية أو متوسطة أو منخفضة أو معدومة. تم فحص فول الصويا العضوي وغير العضوي بمستويات عالية من النشاط ، بينما لم تسجل جميع عناصر الفاكهة والخضروات الأخرى أي نشاط.

مقارنة نتائج فول الصويا إلى منحنى قياسي يظهر أيضا أن لديهم مستويات عالية من نشاط إستروجين في هذا التركيز. تم استخدام مستخلص فول الصويا ، وهو مصدر قوي معروف للإيزوفلافون والدايدزين والجينيستين ، لتحديد التخفيف الذي ينتج عنه إشارة بنسبة 50٪ إلى الحد الأقصى. يتطلب هذا المستخلص 422 مرة تخفيفا أكثر لإنتاج نصف إشارة بروتوكول التخفيف القياسي الخاص بنا.

يمكن إرسال العينات التي تم تحديدها بالنشاط لتحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي لتحديد المواد الكيميائية النشطة. باستخدام طريقة المضادة ، يمكننا أيضا تحديد ما إذا كان الغذاء النباتي يحتوي على مواد كيميائية تقلل من ارتباط ونشاط هرمون الاستروجين الداخلي. تسمح لنا هذه التقنية بزيادة فهمنا لمدى انتشار الأطعمة الاستروجينية في الأنظمة الغذائية للرئيسيات ، وكذلك كيف يؤثر استهلاك الاستروجين النباتي على علم وظائف الأعضاء والسلوك عندما يتم دمج الفحص مع تحليلات الهرمونات البرازية والبيانات الميدانية.