Name: تحريض الخلايا اللبتومينينالتي تعديل عن طريق الحقن داخل الجمجمة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: اكتشف تقنية الحقن داخل الجمجمة بإبرة منحنية لتحرير الجينات في الخلايا اللبتومينينالتي باستخدام الفئران المعدلة وراثياً. تتيح هذه الطريقة دراسة وظائفها في التطور العصبي والأمراض.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد دعمت هذه الدراسة منح من مجلس البحوث السويدي، والجمعية السويدية للسرطان، والمؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية، وكنوت أوتش أليس والينبرغر ستفيلس، وبرنامج البحوث الاستراتيجية في الخلايا الجذعية والطب التجديدي في معهد كارولينسكا (ستراتريجين).

تمت الموافقة على العمليات الجراحية المقدمة بموجب هذا القانون من قبل ستوكهولم نورا Djurförsöksetiska Nämnd ونفذت بالاتفاق مع المواصفات المقدمة من معهد البحوث (معهد كارولينسكا، السويد).
ملاحظة: يمكن تكييف الحقن داخل الجمجمة بمرونة لأغراض بحثية متعددة. نحن نقدم أدناه إجراء وضعت لتسمية بكفاءة الخلايا leptomeningeal لرسم خرائط مصير على أساس حقن endoxifen في خط الماوس المعدلة وراثيا تحمل R26R-tdTomatoe12 وCreER، وهذا الأخير تحت المروج Cx3013. ويمكن أن يتم وضع العلامات على هذه الخلايا من خلال حقن البنى الفيروسية باستخدام نفس الإجراء المبين أدناه. وأخيرا، يمكن استخدام هذا النهج لتتبع تدفق السائل النخاعي، عن طريق ضخ الترايات الفلورية.
1. إعداد نظام الحقن
ملاحظة: نوصي بإجراء العملية في غرفة جراحية مناسبة، وفي ظروف معقمة. يمكن تعقيم الأدوات الجراحية باستخدام الحرارة (الأوتوكلاف، معقم الزجاج) أو تعقيمها باستخدام مطهر كيميائي رفيع المستوى إذا كانت حساسة للحرارة. شطف الأدوات قبل استخدامها عند استخدام التطهير الكيميائي أو السماح لهم بالتبريد عند تعقيمها مع الحرارة.
<ol><li>باستخدام ملقط، ثني إبرة حقنة الحقن إلى 30 درجة في 3 ملم من الطرف. ملاحظة: استخدام حقن هاملتون مع إبرة 30 G متشابكة.</li>
	<li>إعداد 1 ملغ / مل من محلول endoxifen، المخفف في 10٪ DMSO وملء الحقنة مع إبرة عازمة. ملاحظة: إدارة 5 ميكرولتر من المركب لضمان التعرض على نطاق واسع للخلايا الرجالية في الماوس C57Bl/6j الكبار (حوالي 25-30 ز)، على الرغم من التجارب التجريبية التي تختبر تركيزات مختلفة وأحجام الحقن قد تكون ضرورية عند علاج الحيوانات من مختلف الأعمار والسلالات.</li>
	<li>ضبط حامل رأس الماوس بحيث تكون قطعة الفم في حوالي 30 درجة من سطح الجدول الجراحي. ملاحظة: يمكن أيضًا استخدام إطار مجسم مع تثبيت من ثلاث نقاط (أي الأذنين والفم) لهذا الإجراء. في هذه الحالة ، ومع ذلك ، سيتم إصلاح الحيوان فقط مع قطعة الفم ، في حين يمكن تمديد قضبان الأذن تحت أطراف الحيوان الأمامية واستخدامها لدعم جسم الحيوان أثناء الإجراء.</li>
</ol>2. تحريض التخدير
<ol><li>بالنسبة للتخدير اتّصاليّاً، استخدم التركيزات وطرق الإدارة التي أوصت بها الوحدة البيطرية في المؤسسة المحلية.</li>
	<li>بالنسبة للتخدير الاستنشاقي ، مثل الإسوفلوران ، قم بإعداد وحدة الإدارة وفقًا لمواصفات الشركة المصنعة.</li>
	<li>مع إيزوفران، تعيين تركيز المركب في 4٪ لتحريض التخدير.</li>
	<li>تسليم الهواء بمعدل 400 مل/ دقيقة.</li>
	<li>السماح للقسم للتخدير لملء الغرفة مع مخدر لبضع دقائق ووضع الماوس في الغرفة بعد ذلك. ملاحظة: للتجارب الحالية، استخدمنا الكبار (> 2 أشهر من العمر وحوالي 30 ز) الفئران المعدلة وراثيا من الذكور والإناث تحمل Cx30-CreER و R26R-tdTomato، وولدت على خلفية C57Bl/6j.</li>
	<li>مراقبة الحيوان أثناء تحريض التخدير. يجب أن يبطئ نمط التنفس عندما يكون الماوس تحت التخدير الكامل.</li>
	<li>إزالة الحيوان من الغرفة والتحقق من قمع منعكس مخلب عن طريق قرص بدقة الكفوف الخلفية. ملاحظة: قد يكون رد الفعل لا يزال موجودا ولكن تأخر بضع ثوان. إذا كان هذا هو الحال، وضع الحيوان مرة أخرى في الغرفة حتى تم تحقيق قمع كامل من رد فعل مخلب.</li>
	<li>إعطاء مسكن (على سبيل المثال، كاربروفين، 5 ملغ/كغ من خلال الحقن تحت الجلد) للمساعدة في إدارة الألم بعد الجراحة.</li>
</ol>3. تحديد موقع الحيوان لإجراء
<ol><li>أصلح رأس الحيوان على حامل الرأس. لتحسين إمكانية الوصول إلى الصهريج ماجنا ، ضع جسم الحيوان عند حوالي 30 درجة من سطح الطاولة والرأس بعنوان لأسفل ، لإنشاء زاوية 120 درجة مع بقية الجسم وتمديد الجزء الخلفي من الرقبة لتسهيل الوصول إلى الصهريج ماجنا(الشكل 1A).</li>
	<li>إضافة المناشف الورقية تحت الحيوان لدعم جسمه طوال العملية.</li>
	<li>تأمين تسليم التخدير من خلال قطعة الفم وتقليل تركيز الإيزوفدران إلى 2.5٪ وتسليم الهواء إلى 200 مل / دقيقة.</li>
	<li>تطبيق مرهم العيون.</li>
</ol>4. التعرض للسيستيرنا ماجنا
<ol><li>اعمل على التصغير في الجزء الخلفي من رقبة الحيوان وتعقيم المنطقة بـ 70% من الإيثانول والبيتادين.</li>
	<li>باستخدام مقص الجراحية، إجراء شق خط الوسط (حوالي 7 ملم في الطول) بدءا من مستوى العظام القذالية وتمديدها الخلفي.</li>
	<li>يفصل بلطف الأنسجة الضامة السطحية وعضلات الرقبة سحب جانبية من خط الوسط مع ملاقط تلميح غرامة. وهذا سوف يعرض الغشاء الجافي الذي يتراكب على الصهريج ماجنا ، على شكل مثلث مقلوب.</li>
	<li>استخدم رماح امتصاص معقمة أو مسحات قطنية للتحكم في أي نزيف ناتج.</li>
	<li>وضع فاصل جراحي صغير للحفاظ على عضلات الرقبة سحبت جانبا وتمكين التصور من الصهريج ماجنا طوال العملية.</li>
</ol>5. الحقن داخل الجمجمة
<ol><li>للوصول إلى الصهريج ماجنا، حدد نهاية القذالي للعظم القذالي وأدخل الإبرة التي كانت عازمة في السابق مباشرة تحتها. ملاحظة: سيكون هناك انخفاض مفاجئ في المقاومة كما يتم ثقب الغشاء الجاف. ومع ذلك، فإن غيض من إبرة تخترق فقط قليلا تحت سطح الجلد، وذلك بفضل شكله مدمن مخدرات.</li>
	<li>بمجرد أن يتم مبومة الدورة ، اسمح للطرف المنحني للإبرة باختراق تحت سطح الدورة عن طريق سحب الحقنة برفق إلى أعلى وبالتوازي مع جسم الحيوان ، من أجل "ربط" الإبرة بالجمجمة (انظر الشكل 1B). وهذا يضمن استقرار أفضل، وسوف تمنع الإبرة من اختراق أعمق، وبالتالي تجنب خطر إتلاف المخيخ الكامنة أو النخاع.</li>
	<li>حقن المركب ببطء لتجنب التداخل مع التدفق الطبيعي للسائل النخاعي الطبيعي. ملاحظة: اعتمادا على الغرض من التجربة، قد يختلف معدل التسريب. إذا كان معدل التسريب البطيء والمطرد مطلوبًا (على سبيل المثال ، عند استخدام الإجراء لتتبع حركة السائل النخاعي) ، فقد يكون من المستحسن استخدام نظام ضخ صغير آلي بالاقتران مع الحقنة.</li>
	<li>بعد الحقن، والسماح للإبرة بقية في الموقع لمدة 1 دقيقة وإزالته بعناية. استخدام ملقط تلميح غرامة للمساعدة في التراجع عن الإبرة من موقفها مدمن مخدرات. ملاحظة: استخدام إبرة رقيقة (على سبيل المثال، 30 G) لا يؤدي إلى تلف كبير في الغشاء السحادي، وما يترتب على ذلك من تدفق السائل النخاعي. إذا كانت أحجام أكبر إبرة مطلوبة, نوصي بوقف تسرب السوائل عن طريق تطبيق الضغط في موقع الحقن باستخدام طرف القطن المعقم.</li>
</ol>6- اختتام الإجراءات والرعاية اللاحقة للعملية الجراحية
<ol><li>إزالة الفاصل والسماح للعضلات للعودة إلى موقفها الأصلي تراكب الغشاء الجاف.</li>
	<li>أغلق شق الجلد باستخدام بضع قطرات من مادة لاصقة للسيانوكريلات. ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدم الغرز القابلة للامتصاص (على سبيل المثال، 5-0 غرز الفيكريل) وأغلق شق الجلد بغرز متقطعة.</li>
	<li>تطبيق مخدر موضعي (على سبيل المثال، 100 ميكرولتر من الليدوكائين 5٪ ) في موقع الشق.</li>
	<li>إزالة الحيوان من حامل ووضعها في قفص نظيف وضعه على وسادة التدفئة. مراقبة الحيوان حتى يستعيد وعيه. ملاحظة: لا يتوقع أن يسبب هذا الإجراء ألمًا أو ضيقًا طويل الأمد في الحيوان. ومع ذلك ، يجب مراقبة الماوس عن كثب في الأيام الأولى بعد الجراحة ويمكن اتخاذ تدابير لتخفيف الألم كلما ارتئي ذلك ضروريًا ، ووفقًا للتوصيات المقدمة من الوحدة البيطرية في مؤسستك.</li>
</ol>

<ol><li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li>
<li>Whish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+CSF-brain+barrier%3A+developmentally+controlled+access+to+the+brain+via+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 16(2015).</li>
<li>Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meninges+as+barriers+and+facilitators+for+the+movement+of+fluid%2C+cells+and+pathogens+related+to+the+rodent+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).</li>
<li>Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+morphogenic+signaling+initiated+by+the+meninges+controls+corpus+callosum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation.</a> Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).</li>
<li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139 (3), 597-609 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+Radial+Glia-like+Cells+in+Meninges+Migrate+and+Differentiate+into+Functionally+Integrated+Neurons+in+the+Neonatal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces%3A+a+role+for+connexins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li>
<li>Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisterna+Magna+Injection+in+Rats+to+Study+Glymphatic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function.</a> Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).</li>
<li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes%2C+including+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li>
<li>Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+journey+into+the+brain%3A+insight+into+how+bacterial+pathogens+cross+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li>
<li>Slezak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+conditional+gene+manipulation+in+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells.</a> Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).</li>
<li>Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+meningitidis+with+cells+of+the+human+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges.</a> Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).</li>
<li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).</li>
</ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح متنافسة.

البروتوكول المبين هنا يقدم إجراء مباشر واستنساخ لتسمية الخلايا اللولبية لرسم خرائط المصير. نحن نستخدم حقن intracisternal من endoxifen، المستقلب النشط من تاموكسيفين، للحث على التعبير عن مراسل tdTomato الفلورسنت في Cx30-CreER. R26R-tdTomato الفئران12,13.
بالمقارنة مع البروتوكولات الأخرى المستخدمة للوصول إلى السائل النخاعي من خلال الصهريج ماجنا9، يضمن نهجنا إدارة يدوية آمنة بفضل استخدام إبرة عازمة يمكن تثبيتها إلى ...

الخلايا الليبومينينجية هي مجموعة تشبه الخلايا الليفية من الخلايا المنظمة في طبقة رقيقة تتراكب في الدماغ وتعبر عن الجينات المتورطة في ربط الكولاجين (على سبيل المثال، Dcn و Lum)،وفي إنشاء حاجز في الدماغ بيننجيال (على سبيل المثال، Cldn11)1،2. الخلايا اللبتومينينجية متورطة في مجموعة واسعة من الوظائف الفسيولوجية، من الرقابة الصارمة على تصريف السائل النخاعي3 إلى توجيه السلف العصبي في الدماغالنامية 4,5. وقد اقترحت دراسة حديثة أيضا أن اللبتومينينجيات في حديثي الولادة قد تؤوي الخلايا شعاعية مثل غليا التي تهاجر إلى parenchyma الدماغ وتتطور إلى الخلايا العصبية القشرية وظيفية6.
وتقع الخلايا اللبتومينينجيال على مقربة من الخلايا الفلكية السطحية ومشاركتها معهم، فضلا عن استروجليا parenchymal الأخرى، والتعبير عن connexin-30 (Cx30)7. يسمح الإجراء الجراحي المبين أدناه بوضع علامات واسعة النطاق ومحددة لهذه الخلايا الرجالية عبر تسليم الإندوكسيفين لمرة واحدة في الصهريج ماجنا من الفئران المعدلة وراثياً معبرة بشكل مشروط عن tdTomato في Cx30+ الخلايا (أي باستخدام نظام CreER-loxP لرسم خرائط المصير). Endoxifen هو المستقلب النشط من تاموكسيفين ويحفز إعادة تركيب الخلايا التعبير ية عن CreER بنفس الطريقة التي يفعل تاموكسيفين. ومع ذلك ، فمن الحل الموصى به للتطبيق الموضعي لأنه يذوب في 5-10 ٪ DMSO ، بدلا من تركيزات عالية من الإيثانول. بالإضافة إلى ذلك ، لا يعبر endoxifen حاجز الدماغ meningeal ، وبالتالي تمكين إعادة تركيب محددة من الخلايا اللولبية ، دون وضع علامات على السكان Cx30+ astroglial الأساسية (انظر النتائج التمثيلية).
تهدف التقنية المعروضة هنا إلى حقن المركب يدويًا وبأمان في السائل النخاعي ، عبر الوصول المباشر إلى الصهريج ماجنا. على عكس الإجراءات الأخرى الأكثر توغلًا التي تتطلب عملية جراحية في القحف ، يسمح هذا النهج بغرس المركبات دون التسبب في تلف الجمجمة أو parenchyma في الدماغ. وبالتالي ، فإنه لا يرتبط مع تحريض ردود الفعل الالتهابية الناجمة عن تنشيط خلايا غليا parenchymal. على غرار استراتيجيات الحقن الأخرى الموصوفة قبل8,9,10, يعتمد النهج الحالي على التعرض الجراحي لغشاء الدورة القذالي atlanto الذي يغطي الصهريج ماجنا , بعد تشريح حاد لعضلات الرقبة المتراكبة. ومع ذلك ، على عكس الإجراءات الأخرى ، نوصي باستخدام إبرة عازمة عند الطرف ، والتي يمكن تثبيتها ضد العظام القذالية أثناء الإدارة. وهذا سيمنع خطر اختراق الإبرة عميقة جدا وإتلاف المخيخ الكامنة والنخاع.
هذا الإجراء الجراحي متوافق مع تحقيقات تتبع النسب التي تهدف إلى رسم خرائط التغيرات في هويات الخلايا وطرق الهجرة من خلال طبقات parenchymal. كما يمكن تكييفه مع دراسات الاستئصال الوراثية التي تهدف إلى التحقيق في دور الخلايا اللبتومينينجية في الصحة والمرض ، مثل مساهمتها في التنمية القشرية5 أو انتشار التهاب السحايا البكتيري3،11. وأخيرا، يمكن استخدامه لتتبع حركة السائل النخاعي عندما يقترن تسليم التراصد الفلوري في الحيوانات البرية.

<table><tbody><tr><td>وحدة التخدير</td><td>Univentor 410</td><td>8323102</td><td>كاملة من المرذاذ والغرفة والأنابيب التي تتصل بالغرفة وحامل رأس الفأر</td></tr><tr><td>التخدير (Isoflurane)</td><td>باكستر ميديكال AB</td><td>000890</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Orion Pharma AB</td><td>014920</td><td>الاسم التجاري Rymadil</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Carl Roth</td><td>0258.1</td><td>استخدم خيوط حريرية 5-0 ، في</td></tr><tr><td>غراء الأنسجة Medbond</td> البديل <td>Stoelting</td><td>50479</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Endoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8284</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول 70٪</td> <td>Histolab</td><td>01370</td><td></td></tr><tr><td>حقنة هاميلتون (إبرة مشطوفة 30 جم)</td><td>هاميلتون</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>ليدوكائين</td><td>آسبن نورديك</td><td>520455</td><td></td></tr><tr><td>حامل رأس فأر</td><td>Narishige International</td><td>SGM-4</td><td>مع قطعة فم لعلاج التخبط الاستنشاقي. بدلا من ذلك ، استخدم إطارا تجسيميا</td></tr><tr><td>مقص</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>ماكينة حلاقة</td><td>Aesculap</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>رماح امتصاص معقمة</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>18105-01</td><td>مسحات القطن المعقمة هي أيضا خيار</td></tr><tr><td>جيد فاصل جراحي</td> أداة <td>الدقة العالمية</td><td>501897</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط</td><td>دومون</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>فيسكوتيرز</td><td>باوش & أمبير لوب نورديك AB</td><td>541760</td><td></td></tr></tbody></table>

تحريض الخلايا اللبتومينينالتي تعديل عن طريق الحقن داخل الجمجمة

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

يصف البروتوكول المبين هنا كيفية حقن الحلول بأمان ويدويًا من خلال الصهريج ماجنا مع القضاء على خطر تلف parenchyma الأساسية. توصي البروتوكولات المنشورة سابقًا باستخدام إبر مستقيمة يجب خفضها إلى 1-2 مم كحد أقصى من سطح الدورة. إن الانخفاض المفاجئ في المقاومة بمجرد ثقب الغشاء الجافي يجعل من الصعب الحفاظ على الإبرة في وضع ثابت. بدلا ً من ذلك، تستخدم طريقتنا إبرة منحنية عند الطرف الذي يمكن تثبيته ضد العظم القذالي للجمجمة، وبالتالي منع الحقنة من اختراق الأنسجة بعد تعامس الغشاء الجاف. الإجراء بسيط وقابل للتكرار ولا يسبب إزعاجًا طويل الأمد في الحيوانات التي يتم تشغيلها. نحن نصف استراتيجية الحقن داخل الجمجمة في سياق رسم خرائط المصير الوراثي للخلايا اللبتومينينجية الوعائية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام نفس التقنية لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة البحثية، مثل التحقيق في دور اللبتومينينج في التنمية العصبية وانتشار التهاب السحايا البكتيري، من خلال الاستئصال الوراثي للجينات المتورطة بشكل مفترض في هذه الظواهر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج الإجراء مع نظام ضخ آلي للتسليم المستمر واستخدامه لتتبع حركة السائل النخاعي عن طريق حقن الجزيئات الموسومة بفلورية.

حقن intracisternal من endoxifen في الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن CreER تحت المروج Cx3013 ومراسل الفلورسنت لا يمكن اختزالها يسمح لإعادة تركيب محددة من الخلايا اللبتومينينغيال دون وضع علامة على السطح المجاورة Cx30 التعبير والخلايا الفلكية parenchymal في القشرة(الشكل 1). من أجل الوصول إلى الصهريج ماجنا ، يتم وضع الحيوان المُسَسَسَن بجسمه ورأسه بزاوية 120 درجة تقريبًا ، مما يسمح بتمديد الجزء الخلفي من رقبته(الشكل 1...

نحن نصف حقن داخل الجمجمة التي تستخدم إبرة عازمة في الطرف التي يمكن تثبيتها في الجمجمة، وبالتالي القضاء على خطر تلف parenchyma الكامنة. ويمكن استخدام هذا النهج لرسم خرائط المصير الوراثي والتلاعب في الخلايا اللولبية وتتبع حركة السائل النخاعي.

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

تمكن عملية الجراحة لدينا تحرير الجينات محددة من خلايا leptomeningeal لدراسة وظيفتها في العديد من الحالات الفسيولوجية والمرضية مثل النمو العصبي وانتشار التهاب السحايا البكتيري. لتقليل الضرر أثناء التسليم داخل الجمجمة من endoxifen ، نستخدم إبرة عازمة التي يمكن تأمينها ضد حافة السد من الجمجمة لمنعها من اختراق أعمق في الأنسجة. ويمكن استخدام هذا الإجراء للتحقيق في دور الجينات التي تعبر عن الخلايا اللينتومينية من خلال فقدان واكتساب تجارب الوظيفة.ويمكن أيضا أن تعتمد لتتبع تدفق السائل النخاعي. سوف مظاهرة بصرية من هذه الطريقة ضمان تحديد ناجحة من موقع الحقن للحقن intracisternal وفهم كيفية تأمين الإبرة ضد عظم القذالي. تبدأ من خلال إعداد حقنة هاملتون مع إبرة مشطوفة قياس 30 للحقن.استخدام ملقط لثني الإبرة إلى 30 درجة ثلاثة ملليمترات من طرف. المقبل, تخفيف endoxifen في 10٪ DMSO إلى تركيز واحد مليغرام لكل ملليلتر والردم الحقنة. تخدير الحيوان في غرفة ايزوفلوران.ثم ضبط حامل رأس الماوس بحيث يكون لسان حال تقريبا في زاوية 30 درجة من سطح الجدول الجراحي وإصلاح رأس الحيوان على حامل. لتحسين إمكانية الوصول إلى ماغنا سيستيرنا، ضع جسم الحيوان عند حوالي 30 درجة من سطح الطاولة مع الرأس مائل للأسفل والذي سينشئ زاوية 120 درجة مع بقية الجسم ويمتد الجزء الخلفي من الرقبة لتسهيل الوصول إلى ماغنا سيستيرنا. مرة واحدة يتم وضع الحيوان بشكل صحيح، وتطبيق مرهم العيون، حلق الجزء الخلفي من رقبته، وتطهير المنطقة مع مناديل الكحول وبيتادين.استخدم المقص الجراحي لعمل شق في خط الوسط يبدأ من مستوى العظم القذالي ويمتد من الخلف. فصل بلطف النسيج الضام السطحي وعضلات الرقبة عن طريق سحب جانبية من خط الوسط مع ملاقط تلميح غرامة والتي سوف تعرض غشاء دورال الإفراط في magna cisterna. ضع فاصل جراحي صغير لتمكين التصور للماجنا cisterna طوال العملية.تحديد نهاية السد من عظم القذالي وإدراج إبرة عازمة سابقا تحت مباشرة. مرة واحدة وقد ثقب dura، والسماح غيض عازمة من إبرة لاختراق تحت السطح عن طريق سحب بلطف حقنة صعودا وموازيا لجسم الحيوان الذي سيضمن استقرار أفضل. حقن المركب ببطء لتجنب التداخل مع تدفق السائل النخاعي الطبيعي.بعد الحقن، والسماح للإبرة بقية داخل لمدة دقيقة واحدة، ثم إزالته بعناية مع مساعدة من ملقط تلميح غرامة. أغلق الجلد ببضع قطرات من مادة السيانواكريلات اللاصقة، ثم ضعي مخدر موضعي في موقع الحقن. إزالة الحيوان من حامل ووضعها في قفص نظيف على وسادة التدفئة.ثم تأكد من مراقبة الحيوان حتى يستعيد وعيه. الحقن داخل الجمجمة من endoxifen في الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن Creer تحت المروج Cx30، مراسل الفلورسنت غير قابل للتكرير يسمح لإعادة الكومبتورة محددة من الخلايا اللينتومينانجية دون وضع علامة Cx30 المجاورة التعبير عن الخلايا الفلكية السطحية وparenchymal الفلكيات في القشرة. يستفيد بروتوكول الحقن هذا من الحركة الفسيولوجية للسائل النخاعي، لذا يتم توزيع محلول الإندوكسيفين في جميع أنحاء الفضاء تحت العنكبوتي للخلايا اللبانية التي تحتوي على خلايا ليمبتينجية لإعادة الكومبون بكفاءة فوق المصابيح الشمية والقشرة والمخيخ.الحل لا يعبر حاجز السحا الدماغ أو يأتي في اتصال مع الخلايا الفلكية من parenchyma بدلا من الإدارة النظامية من خلال gavage الشفوي. تم تحديد إعادة دمج الخلايا العديمة بعد الحقن داخل الجمجمة من خلال تفاعل Pdgfr-Alpha في حين ظلت الخلايا الفلكية السطحية والبارينشيمية المعبرة عن Gfap غير مُصمَّم. عند محاولة هذه التجربة، من المهم تحديد موقع الحقن للتسليم داخل الجمجمة.يوفر هذا العرض التوضيحي المرئي الدراية الفنية لتنفيذ الإجراء مع تقليل خطر إتلاف الأنسجة العصبية تحته. ويمكن إجراء دراسات الاستئصال الجيني باستخدام هذه التقنية للتحقيق في دور الخلايا اللينتومينية في تكوين الكورتيوجين وتنظيم تكوين السائل النخاعي وتحديد مواقع إضافية لنشر البكتيريا في الفضاء دون العنكبوتي.

induction-leptomeningeal-cells-modification-via-intracisternal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

المصدر: Zamboni، M.، et al.، تحريض تعديل الخلايا البريمية السحائية عن طريق الحقن داخل الخزان. J. Vis. Exp. (2020)يوضح هذا الفيديو إجراء توصيل دواء محفز إلى صهريج فأر مخدر. يحفز الحقن بشكل انتقائي التعبير عن علامات الفلورسنت في خلايا سطح الدماغ التي يمكن الوصول إليها عن طريق السائل النخاعي ، والتي يؤكدها التصوير الفلوري.

توصيل الدواء المستهدف في نموذج الفأر عبر حقن Cisterna Magna

في هذا الفيديو ، نصف إجراء توصيل الخلايا السرطانية المشتقة من الإنسان إلى صهريج ماجنا في دماغ الفأر. يمكن استخدام نموذج الفأر التقويمي لدراسة الانتشار النقيلي للسرطان إلى السحايا القحفية.

حقن الصهاريج الجراحية ماجنا: طريقة لإعطاء الخلايا السرطانية مباشرة في الجهاز العصبي المركزي لنموذج الفئران

في هذا الفيديو ، نوضح التوصيل داخل الخزف للنيسرية السحائية في نموذج فأر لتوليد عدوى التهاب السحايا.

توصيل المكورات السحائية داخل القناة إلى نماذج الفئران للحث على التهاب السحايا بالمكورات السحائية

يوضح الفيديو طريقة لإنشاء نموذج للفئران مع إزالة الميالين القشري الدماغي على نطاق واسع. يتضمن ذلك تعطيل الحاجز الدموي الدماغي عن طريق حقن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات في الفئران المعدة ببروتين غمد المايلين المؤتلف. تسهل هذه العملية تسلل الخلايا المناعية ، مما يؤدي إلى إزالة الميالين القشري الدماغي على نطاق واسع.

توليد إزالة الميالين القشري الدماغي على نطاق واسع في نموذج الفئران

في هذا الفيديو ، تم إنشاء نموذج فأر للتصلب المتعدد باستخدام التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). يتم حقن الفأر بمستحلب يحتوي على ببتيد عصبي ومادة مساعدة ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية تنشط الخلايا التائية ذاتية التفاعل. يتبع ذلك حقن سم السعال الديكي (PTX) لزيادة نفاذية الحاجز الدموي الدماغي ، مما يسمح للخلايا التائية ذاتية التفاعل بالتسلل إلى الدماغ. يبدأ هذا التسلل في سلسلة إشارات تؤدي في النهاية إلى تلف المايلين ، مما يحاكي حالة إزالة الميالين للتصلب المتعدد.

تحريض التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي في نموذج الفأر

يسمح البروتوكول المعروض هنا بإعادة إنتاج مادة رمادية واسعة الانتشار لإزالة الميالين من نصفي الكرة الأرضية القشرية في فئران أغوتي الداكنة الذكور البالغين. وتتألف هذه الطريقة من زرع داخل الدماغ من القسطرة, التحصين دون السريري ضد المايلين oligodendrocyte بروتين غليكوبروتين, وحقن داخل الدماغ من خليط السيتوكين الموالية للالتهابات من خلال القسطرة المزروعة.

نموذج الفئران من إزالة المزيل القشرية الدماغية على نطاق واسع الناجمة عن الحقن داخل الدماغ من السيتوكينات الموالية للالتهابات

هنا ، ونحن وصف طريقه للحث علي التهاب السحايا المكورات السحائية من خلال طريق إينتراسيستيرنال من العدوى في الفئران الكبار. نقدم بروتوكول خطوه بخطوه للعدوى بالمكورات السحائية من اعداد الاصابه بالعدوى الإينتراسيستيرناله. ثم تسجيل البقاء علي قيد الحياة الحيوانية وتقييم الأحمال البكتيرية في الانسجه murine.

حمل التهاب السحايا السحائي Serogroup C في الفئران عن طريق تسليم إينتراسيستيرنال

هنا، ونحن نصف نموذج زينوغرافت مورين الذي يشبه وظيفيا خزان أومايا في المرضى. طورنا مورين أوميا لدراسة العلاجات الجديدة لمرض اللبتومينينيال القاتل عالميا.

نموذج مورين أومايا زينوغرافت لدراسة العلاج المباشر المستهدف لمرض اللبتومينينجال

يحدد هذا البروتوكول تعليمات خطوة بخطوة لإجراء الحقن داخل القراب في الفئران الوليدية لتحرير الجينات وتوصيل الأدوية.

الحقن داخل القراب للفأر حديث الولادة لتحرير الجينوم وتوصيل الدواء

يصف البروتوكول طريقة لحقن الخلايا السرطانية من خلال طريق البزل عن طريق الجلد في صهريج ماجنا الذي يحفز بقوة ورم خبيث في الفئران ، مما يقلل من الصدمة وعبء الورم خارج الجمجمة.

نموذج حقن Cisterna Magna طفيف التوغل لدراسات ورم خبيث البريماني السحائي في الفئران

هنا، يعرض بروتوكول لتقييم الأوعية اللمفاوية السحائية للفئران (MLVs)، التي تلعب دورا مهما في الأمراض العصبية المتعددة. هدف هذا البروتوكول هو توفير طريقة متكاملة تمكن من التقييم الوظيفي لتصريف التتبع وتوصيف الشكل التفصيلي لشبكة MLVs الظهرية.

بروتوكول متكامل لتقييم أمراض اللمفاوية السحائية: حقن ماجنا السيسترنا، تصوير العقد اللمفاوية، تشريح السحايا، والتلوين على كامل القاعدة

اكتشف تقنية الحقن داخل الجمجمة بإبرة منحنية لتحرير الجينات في الخلايا اللبتومينينالتي باستخدام الفئران المعدلة وراثياً. تتيح هذه الطريقة دراسة وظائفها في التطور العصبي والأمراض.

تحريض الخلايا اللبتومينينالتي تعديل عن طريق الحقن داخل الجمجمة

استكشف المزيد من الفيديوهات