ارتفاع الإنتاجية الخميرة سلالة Phenotyping مع تسلسل الحمض النووي الريبي القائم على دروبليت

ICO، أو ICO-eq هو أول تكييف لتسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية للميكروبات. وقد قيّمت هذه الطريقة الدالة الميكروبية على نطاق الجينوم. بالنسبة للميكروبات المهندسة ، يمكن لهذه الطريقة توضيح كيف يمكن للتغيرات في الجينوم الميكروبي أن تُعطل وظائفها.

الحصول على الخميرة من ثقافة تعليق، وعد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني بتركيز حوالي 750،000 خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك، اخلطي نقطة الانصهار المنخفضة للغاية في PBS، واسخني الخليط عند 90 درجة مئوية، حتى يذوب الأاروز.

قم بتحميل خليط agarose في حقنة، مع فلتر 0.22 ميكرون مرفق. ضع مضخة حقنة أمام سخان الفضاء تعيين إلى 80 درجة مئوية ووضع الحقنة في المضخة. ملء حقنة ثانية مع تعليق الخميرة، وملء حقنة ثالثة مع النفط المفلور، مع 2٪ الفلوروسورفاكت.

قم بتحميل كل من الحقن في مضخات الحقن. توصيل الأنابيب من الحقن إلى الجهاز A.Place أنبوب مخروطي 15 ملليلتر في دلو الثلج، وتوجيه أنبوب منفذ في أنبوب مخروطي. تعيين معدل تدفق كل حقنة، وجمع ما يقرب من ملليلتر واحد من مستحلب في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.

بعد انتظار خمس دقائق لأغاروز في أنبوب لتعيين، إضافة حجم متساو من 20٪ بيرفلورو-اوكتانول في النفط المفلور إلى مستحلب. اخلطي المستحلب والبيرفلورو-أوكتانول عن طريق عكس الأنبوب المخروطي عدة مرات. جهاز طرد مركزي مستحلب مكسورة في 2،000 مرات G لمدة دقيقتين.

تأكد من أن الهيدروجيل قد بيليت فوق مراحل النفط وPFO. إزالة النفط وPFO مراحل. إضافة ملليلتر اثنين من tet(W) العازلة لإعادة تعليق الهيدروجيل.

نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي جديد 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب مرة أخرى في 2،000 مرات G لمدة دقيقتين. إزالة الفائقة، وإعادة تعليق الهيدروجيل في tet(W)مرة أخرى.

بعد الغزل أسفل الهيدروجيل في 2، 000 مرات G لمدة دقيقتين، إعادة تعليق الهيدروجيل في مليلتر اثنين من متوسطة ثقافة الخميرة. احتضان الأنبوب بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، مع اهتزاز. كل سلالات تنمو بمعدلات مختلفة.

اختيار وسائل الإعلام المناسبة ووقت الحضانة أمر ضروري لضمان أن تنمو الخميرة داخل الهيدروجيل، ولكن لا overgrow، مما يؤدي إلى الخلايا الهروب إلى وسائل الإعلام. أولاً، نقل الهيدروجيل إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 2،000 مرة G لمدة دقيقتين.

غسل الهيدروجيل مرتين مع برنامج تلفزيوني ومن ثم مرة واحدة في عازلة رأب الصد. تنفيذ تخفيف 40x من الانزيم الرأب في التخزين المؤقت للرأب. ثم، إضافة ملليلتر واحد من الانزيم المخفف إلى الهيدروجيل.

احتضان أنبوب الهيدروجيلس في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. الخميرة المعالجة سوف تبدو أكثر شفافية. من الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الهيدروجيل، اسحب 0.8 ملليلتر من التعليق من أسفل الأنبوب، ونقله إلى حقنة غير مغطاة بميليلتر واحد.

ضع الحقنة في حامل الحقنة المطبوعة ثلاثية الأبعاد. جهاز طرد مركزي الحقنة وحامل في 2،000 مرات G لمدة دقيقتين. قبل المضي قدما، تأكد من أن hydrogels معبأة بإحكام في الجزء السفلي من الحقنة.

مكان 240،000 قطرة seq حبات في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 1،000 مرات G لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant، وإعادة تعليق الخرز في مليلترين من 0.9x العازلة تحلل الخميرة، مع كلوريد الصوديوم 500 ملليمولار.

أدخل شريطًا مُحرّكًا، واقل تعليق الخرز إلى حقنة ذات ثلاثة ملليلتر. إعداد حقنة أخرى، تحتوي على عدة ملليلترات من PFPE-PEG السطحي في الزيت المفلور. الحصول على حقنة أعدت مسبقا من استنساخ الخميرة معبأة هيدروجيلس.

أخلي رأس الإذعان، و اِختم الحقنة. أدخل المحاقن الثلاثة، الهيدروجيل، تعليق الخرز، والزيت في مضخات الحقن. توصيل الحقن عن طريق أنابيب إلى الجهاز B، جهاز التغليف.

ضع نهاية المأخذ في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر على الجليد. تعيين معدل تدفق كل حقنة. جمع ما يقرب من 1،000 ملليلتر من مستحلب، أو تشغيل الجهاز حتى لا يكون هناك هيدروجيلات المتبقية.

ثم اتبع بروتوكول الإسقاط-seq لتوليف cDNA والإعدادية مكتبة والتسلسل. باستخدام جهاز microfluidic، تم تغليف خلايا الخميرة في قطرات 160 ميكرومتر. قسم مقسم ثمانية أضعاف هذه القطرات إلى ثماني قطرات 60 ميكرومتر.

أدى الحضانة بين عشية وضحاها في مستعمرات الخميرة ايزوجينيك تنمو داخل بعض الهيدروجيل. قبل تحميل الهيدروجيل الخميرة في الجهاز microfluidic الثاني، تم غسلها وغمرها في حل لهضم جدران الخلية. تم التحقق من الهضم السليم عن طريق المجهر ، مع خلايا الخميرة المعالجة وجود مورفولوجيا أكثر عاكسة.

تم خلط تيار من حبات التقاط مرنا في عازلة التحلل مع تيار من هيدروجيلات الخميرة وثيقة حزمة قبل تقاطع صنع قطرة من الجهاز microfluidic الثاني. في المستحلب الناتج ، حوالي 10 ٪ من القطرات التي تم جمعها تحتوي على حبة واحدة مع مستعمرة مليسة. تم استخدام سير عمل تسلسل المستعمرة isogenic لتحليل استجابة التبديل الأبيض المبهم من C.albicans.

ويشير المكون الرئيسي، وPC، والتحليل، والحد من الأبعاد tSNE إلى التوافق العام بين مجموعة بيانات العينة ومجموعة البيانات المرجعية. وكشف تحليل TSNE ثلاث مجموعات من الخلايا. وفي حين أن المجموعة الثانية كانت تتألف في الغالب من خلايا من مجموعة بيانات العينة، فإن المجموعتين صفر وأخرى كانت تتألف من خلايا من كلتا العينتين.

تراكب WH11 التعبير على tSNE أشار إلى أن كتلة واحد على الأرجح تحتوي على مستعمرات بيضاء. زيادة التعبير STF2 في نظام واحد، بما يتفق مع البيانات التي تم الحصول عليها مسبقاً. في المجموعتين صفر واثنان، تم تنظيم WH11 و STF2 بشكل ملحوظ مقارنة بالفئة الأولى.

الميكروبات الاندروجين لديها إمكانات متزايدة لإنتاج البيولوجيا على نطاق واسع لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض. بعد هذا الإجراء، يمكن للمرء تطبيق مجموعة متنوعة من الأدوات الحيوية لتحليل مزيد من البيانات التسلسل.