Name: في الموقع التهجين لسيبونكولوس nudus Coelomic السائل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: اكتشف طريقة التهجين الموضعي لتحليل توطين الرنا المرسال في السائل الخلطي لدى Sipunculus nudus. تتيح هذه التقنية تصور أنماط التعبير الجيني بدقة عالية في الكائنات البحرية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد دعم هذا العمل صندوق العلماء الشباب التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31801034)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة فوجيان، الصين (2016J01161)، وصناديق البحث العلمي في جامعة هواتياو (15BS306) والصندوق المبتكر للدراسات العليا في البحث العلمي بجامعة هواتشياو.

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان ورعاية الحيوان بجامعة هواتشياو على اجراء الحيوان .
1. ريبوسوبر التحضير
<ol><li>تصميم التمهيدي<ol>
<li>افتح برنامج التمهيدي 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). نسخ تسلسل dmrt1 (GenBank: MK182259) في إطار التسلسل.</li>
		<li>تعيين طول التمهيدي (23-25 نقطة في الثانية)، درجة حرارة الذوبان (55-60 درجة مئوية)، ومحتوى G/C (40-60٪). انقر فوق اختيار التمهيديات. ملاحظة: الحد الأدنى من الحجم المطلوب للتحقيق الحمض النووي الريبي هو حوالي 500 bp. تحقيقات أطول عادة ما يكون أعلى خصوصية.</li>
		<li>إضافة T7 RNA البوليميراز مروّز تسلسل (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3, ) إلى واحدة من التمهيديات المختارة., يتم عرض تسلسل التمهيدي dmrt1 لـ ISH في الجدول 1. ملاحظة: للحصول على تحقيقات الإحساس، يقع T7 RNA polymerase المروج في نهاية 5 'من التمهيديات إلى الأمام. للتحقيقات antisense، يقع T7 RNA polymerase المروج في نهاية 5'-من التمهيديات العكسي.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تضخيم PCR<ol>
<li>ضع أنابيب الميكروفوج على الجليد، وأعد مزيج التفاعل التالي (لرد فعل 50 ميكرولتر): 1x مزيج البوليميراز الحمض النووي للقواق، 1 ميكروغرام من cDNA (الذي يتم إعداده من 100 ميكرولتر من السائل الكيوم)، 1 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 1 ميكرومتر التمهيدي العكسي والمياه الخالية من nuclease.</li>
		<li>خلط تفاعل PCR عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة.</li>
		<li>ضع أنبوب التفاعل في الدورالحراري الحراري ، وقم بتشغيل PCR باستخدام الشروط التالية: التسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين تليها 36 دورة من التنحني عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ق ، والظهر عند 55-60 درجة مئوية لمدة 30 ق ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ق والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقيقة. ملاحظة: يجب تحسين درجة حرارة الصلب وفقًا للالتمهيديات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تنقية منتجات PCR والتحقق من صحتها<ol>
<li>قم بتحميل 50 ميكرولتر من خليط PCR مباشرة على جل أغاروز 1٪. تشغيل هلام agarose في 150-180 V لمدة 10 دقيقة في 0.5x TBE. عزل شظايا الحمض النووي محددة من هلام أغاروز 1٪. ملاحظة: يجب أن يظهر الحمض النووي كشريط واحد وليس كمسحة.</li>
		<li>تنقية شظايا الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قياس المنتجات النقية عن طريق قياس الطيف الضوئي على طول موجة من 260 نانومتر.</li>
		<li>التحقق من صحة منتجات PCR عن طريق التسلسل. ملاحظة: (نقطة الإيقاف المؤقت) يمكن تخزين منتجات PCR المنقى عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تخليق الريبوسبر<ol>
<li>ضع أنابيب الميكروميج الخالية من RNase على الجليد ، وأضف ما يلي إلى أنبوب الميكروفوج (لرد فعل 10 ميكرون): 1x Digoxygenin RNA الوسم ميكس ، 1x النسخ الاحتياطي ، 0.5 ميكرولتر من مثبطات RNase ، 1 ميكرولتر من بوليمرات الحمض النووي الريبي T7 ، 1 ميكروغرام من منتج PCR والماء الخالي من RNase. خلط رد الفعل عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>إضافة 2 μL من DNase خالية من DNase I. مزيج التفاعل عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>إضافة 2 μL 0.2 M EDTA (درجة الحموضة 8.0). خلط رد الفعل عن طريق الأنابيب والطرد المركزي لفترة وجيزة.</li>
		<li>أضف 2.5 ميكرولتر من 4 M LiCl و 75 ميكرولتر من الإيثانول المبرد مسبقًا إلى رد الفعل المذكور أعلاه. تخلط جيدا. يترك لمدة 30 دقيقة عند -70 درجة مئوية.</li>
		<li>الطرد المركزي عند 12,000 × غرام لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ديكانت الإيثانول. أضف 1 مل من الإيثانول المبرد مسبقًا بنسبة 70٪ (v/v) واغسل هطول الأمطار عن طريق الاختلاط بلطف.</li>
		<li>الطرد المركزي عند 12,000 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. Decant الإيثانول 70٪ وتجفيف هطول الأمطار لفترة وجيزة بالقرب من مصباح الكحول. حل هطول الأمطار عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase وتخلط بلطف.</li>
		<li>تحميل 2 μL من الحمض النووي الريبي توليفها على هلام أغاروز 1٪. تشغيل هلام agarose في 180 V لمدة 5-10 دقيقة في 0.5x TBE. قياس تركيز الحمض النووي الريبي المسمى باستخدام مطياف على طول موجة من 260 نانومتر.<ol>
<li>استخدم أنابيب المايكروفوج الخالية من RNase ونصائح التصفية لتجنب تلوث RNase. ملاحظة: (نقطة الإيقاف المؤقت) يمكن تخزين المسابير المسماة بالديأكسجينين عند -70 درجة مئوية لعدة أشهر.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2- جمع السوائل الكيومية
<ol><li>إصلاح nudus S. على الجدول تشريح مع دبابيس. فتح الجسم من النودوس S. مع مقص الأوتوكلاف الصغيرة. عزل السائل الكيوم مع ماصة.</li>
	<li>جمع ونقل 1 مل السائل الكل الكل مع ماصة إلى شرائح المجهر متعدد الأبعاد المعالجة. تطبيق السائل coelomic بالتساوي مع طرف ماصة. الهواء الجاف الشرائح لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.</li>
</ol>3- التهجين في الموقع
<ol><li>اليوم الأول<ol>
<li>Rehydrate الشرائح في جرة تلطيخ الشريحة التي تحتوي على 100 مل من 1x ديثيل بيروكربونات معالجة الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (DEPC-PBS). Rehydrate 3 مرات مع 1x DEPC-PBS، 5 دقيقة لكل غسل مع الانفعالات لطيف.</li>
		<li>Permeabilize مسحة السائل الكوليسيوم عن طريق الهضم مع 10 ميكروغرام / مل بروتينات K في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة. احتضان الشرائح في 4٪ من البارافورمالديهايد (PFA) لمدة 20 دقيقة لوقف الهضم. غسل الشرائح في 1x DEPC-PBS مع الانفعالات لطيف لمدة 5 دقيقة 3 مرات.</li>
		<li>أضف 50 ميكرولتر من مزيج التهجين (HM) الذي يحتوي على مسبار الريبوز بالإحساس/التحسس المضاد على الشرائح وإضافة زلة غطاء.</li>
		<li>إضافة مربع الرطب المخزن المؤقت في المربع الرطب. وضع الشرائح في مربع الرطب وختم جيدا مع فيلم البارافين. تهجين بين عشية وضحاها (على الأقل 16 ساعة) في 60 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>اليوم الثاني<ol>
<li>سخني المخزن المؤقت للغسيل على حرارة 65 درجة مئوية. تزج الشريحة في جرة تلطيخ الشريحة التي تحتوي على المخزن المؤقت لغسل والسماح لها الوقوف حتى شرائح coverslip قبالة تلقائيا. يستغرق حوالي 5 دقيقة.</li>
		<li>اغسل مرتين بالسعة المؤقتة للغسيل عند درجة حرارة 65 درجة مئوية، و30 دقيقة لكل غسل مع تهيج لطيف. اغسل 2 مرات مع سترات المحلول ة المالحة والصوديوم (SSC) عند درجة حرارة 65 درجة مئوية، و30 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. يغسل مرتين مع حمض ماليك العازلة التي تحتوي على Tween 20 (MABT) في درجة حرارة الغرفة، 30 دقيقة لكل غسل مع الانفعالات لطيف.</li>
		<li>احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 ساعة في المخزن المؤقت للحظر. احتضان الشرائح في 1 مل المضادة digoxigenin-AP فاب شظايا الشظايا المخفف في 1/5000 مع عازلة حظر في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	</ol>
</li>
	<li>اليوم الثالث<ol>
<li>إزالة حل الأجسام المضادة وغسل الشرائح لفترة وجيزة في مابت. اغسل 4 مرات مع مابت في درجة حرارة الغرفة، 25 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف.</li>
		<li>احتضان الشرائح مع العازلة فوسفاتاز القلوية في درجة حرارة الغرفة 3 مرات، 5 دقيقة لكل غسل. إزالة العازلة فوسفاتازي القلوية، وإضافة 1 مل من 5-برومو-4-الكلورو-3-indolyl الفوسفات (BCIP)/نيترو الأزرق رباعي التروسيوم (NBT) محلول تلطيخ. إبقاء الشرائح في الظلام.</li>
		<li>مراقبة رد فعل اللون بشكل دوري تحت المجهر البصري. عندما يتم تطوير اللون بالكامل (وقت رد الفعل في نطاق 1-4 ساعة)، اغسل الشرائح مرتين مع MABT في درجة حرارة الغرفة، 5 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف.</li>
		<li>اغسل 2 مرة مع محلول التوقف في درجة حرارة الغرفة، 15 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. احتضان الشرائح في الميثانول لإزالة وصمة عار الزائدة، في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وفقا للون الخلفية، يمكن أن يتم غسل الميثانول 2 أو 3 مرات ويمكن تمديد وقت إزالة اللون.</li>
		<li>اغسل 2 مرات مع مابت في درجة حرارة الغرفة، 5 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. نقل الشرائح إلى ورقة تصفية جديدة. إضافة 50 ميكرولتر من الجلسرين. إضافة coverslips ومراقبة مجهرية. ملاحظة: يتم عرض تكوين الحل في الجدول 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li>
<li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li>
<li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li>
<li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li>
<li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884(2009).</li>
<li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721%2C+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li>
<li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li>
<li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li>
<li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt1%2C+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators%2C+is+required+for+mammalian+testis+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).</li>
<li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li>
<li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41(2012).</li>
<li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Hydrobiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361(1993).</li>
</ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

أظهرت الدراسات السابقة أن ISH مناسبة للكشف عن RNAs متعددة الهدف16،17،18. في هذا البروتوكول، وصفنا طريقة ISH عالية الدقة للكشف عن مرنا في السائل coelomic والتأكيد على ظروف التهجين الأمثل في سيبونكولوس nudus. أظهرت الإشارات الواضحة لـ dmrt1 التي لاحظناها التطبيق الناجح لهذا البروتوكول في الكشف عن التعبير الجيني(الشكل 2).
خلال التجربة، يجب إيلاء سلسلة من ال...

ISH، وذلك باستخدام مسبار الحمض النووي المسمى للكشف عن الحمض النووي محددة أو تسلسل الحمض النووي الريبي من الفائدة، هو وسيلة مفيدة لوصف نمط التعبير المكاني للجينات المستهدفة في الأنسجة المحفوظة شكليا1،2،3. عادة ، يتم إنشاء تسلسل الهدف عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ثم يستخدم كقالب لتوليف مسبار الحمض النووي الريبي المضاد / الإحساس المسمى بيوريدين-5-ثلاثي الفوسفات digoxigenin. يتم إصلاح العينات وpermeabilized قبل الحضانة مع الريبوسبر. بعد غسل قبالة التحقيق الزائد، يتم تصور التهجين من قبل الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة للأكسجين، وهو القلوية فوسفاتاز مترافق3،,4،,5،,6.
Sipunculus nudus (فيلوم سيبوناولا؛ النظام Sipunculida: Sipunculidae) هو دودة بحرية غير مجزأة، coelomate ومتناظرة ثنائيا7،8. Sipunculus nudus هو نوع عالمي موزعة على نطاق واسع في المياه الساحلية الاستوائية والمعتدلة. كما أنها مورد صيد بحري مهم في جنوب الصين بسبب قيمها الغذائية والطبية العالية9،10. ومع ذلك ، فإن Sipunculus nudus في البيولوجيا الجزيئية لا يزال في مراحله الأولى. لفهم الدور البيولوجي للجينات بشكل كامل ، فإن التحقيق في أنماط تعبير الجينات في قرار خلوي هو أمر مهم بشكل كبير. في الكائن غير النموذجي Sipunculus nudus، لم يتم بعد إنشاء طريقة ISH ، وهي طريقة مثالية للكشف عن أنماط تعبير الجينات. يحتوي السائل الكائي على عدة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الحبيبية ، وخلايا الجر ، والخلايا العمودية ، والخلايا الجرثومية ، والكريات الحمراء ، وما إلى ذلك11. الجنس المزدوج / ماب-3 عامل النسخ ذات الصلة-1(dmrt1),تستخدم كجين تمثيلي في هذه الطريقة, هو منظم النسخ المحفوظة للغاية من تحديد الجنس والتمايز في معظم الأنواع التي تتراوح بين اللافقاريات إلى الثدييات12,,13. في مجموعة من الأنواع (أي الإباحية السوداء، وما إلى ذلك) 14, تم التعبير عن dmrt1 في خلايا سيرتولي, المحيطة الخلايا الانباتية, وظيفتها مماثلة لخلايا التروبهوبلاس سبونكولوس. لذلك ، افترضنا أن dmrt1 من Sipunculus nudus يتم التعبير عنه في الخلايا الغذائية من الحيوانات المنوية ، ونتيجة لطريقة ISH أكدت بوضوح الفرضية.
يصف هذا البروتوكول لأول مرة ISH ، مع تحقيقات antisense/sense ssense /sense ssense ، لتحديد أنماط تعبير مرنا في مسحة السائل الكوافي. يتم توفير ظروف التفاعل الأمثل ، والتي تسمح بتصور حساس للغاية للتعبير مرنا بدقة عالية. يمكن تطبيق طريقة ISH المطورة في أنواع سيباونكوليدا أكثر من Sipunculus nudus.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>شظايا Anti-digoxigenin-AP Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCI / NBT طقم تطوير لون الفوسفاتيز القلوي</td><td>Beyotime</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>مصل البقر الألبومين</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr> أجهزة <tr><td>الطرد المركزي</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>حامض</td> <td>الستريكشركة سينوفارم للكاشف الكيميائي</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>حامض الستريك ثلاثي الصوديوم</td><td>سينوفارم الكاشف الكيميائي</td><td>4/3/6132</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Beyotime</td><td>FCGF60</td><td></td></tr><tr><td>فورماميد منزوع الأيونات</td><td>Amresco</td><td>12/7/1975</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي إيثيل بيروكربونات ، DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>مادة ضارة</td></tr><tr><td>Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNase I ،</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td> خال من RNase <td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>جل الرحلان الكهربائي التصوير</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood III</td><td></td></tr><tr>شركة <td>الكاشف الكيميائي للإيثانول سينوفارم</td><td></td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>مجموعات استخراج الجل</td><td>أوميغا</td><td>D2500</td><td></td></tr><tr><td>جهاز الرحلان الكهربائي الهلامي</td> مصنع <td>بكين Liuyi</td><td>للأدوات DYY-6C</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>جلايسين</td><td>سيجما</td><td>G5417</td><td></td></tr><tr><td>الهيبارين</td><td>سيجما</td><td>8/1/9041</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>شركة كاشف سينوفارم الكيميائي</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma</td><td>203637</td><td></td></tr> شركة <tr><td>كاشف كيميائي لحمض الماليك</td><td>Sinopharm</td><td>110-16-7</td><td></td></tr><tr><td>شركة كاشف الميثانول سينوفارم للكيماويات</td><td></td><td>67-56-1</td><td>مادة ضارة</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>Biofount</td><td>JT0001</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td>سينوفارم كاشف كيميائي</td><td>1310-73-2</td> فيلم البارافين <td>المسببة للتآكل</td></tr> شركة <tr><td></td><td>Bemis، Inc.</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde ، PFA</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>مادة ضارة</td></tr><tr><td>PCR أداة</td><td>Life Technology</td><td>دبابيس Proflex</td><td></td></tr><tr><td>دبابيس</td><td>ديلي</td><td>16</td><td></td></tr><tr><td>ماصة</td><td>Eppendorf</td><td>plus G</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine المجهر المعالج</td><td>شرائح Liusheng</td><td>VER_A01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>SRE0005</td><td></td></tr><tr><td>RNase ماء خال</td><td>من HyClone</td><td>SH30538. 02</td><td></td></tr><tr><td>RNase مثبط</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>S. nudus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>مصل الأغنام</td><td>Beyotime</td><td>C0265</td><td></td></tr><tr><td>جرة تلطيخ منزلقة</td><td>Beyotime</td><td>FG010</td><td></td></tr><tr><td>صندوق تخزين الشرائح</td><td>Beyotime</td><td>FBX011</td><td></td></tr><tr><td>مقص صغير معقم</td><td>Shuanglu</td><td>sku_8330</td><td></td></tr><tr><td>مقاييس الطيف</td><td>الضوئي Thermo Fisher</td><td>NanoDrop 2000 / 2000c</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerases</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase mix (2X)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109517001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>حمام مائي</td><td>Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial</td><td>HH-S2</td><td></td></tr></tbody></table>

في الموقع التهجين لسيبونكولوس nudus coelomic السائل

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

التهجين في الموقع (ISH) هو تقنية مفيدة للغاية لتقديم أنماط التوزيع الخلوي لجينات محددة (على سبيل المثال، مرنا وncRNA) في الأنسجة. دودة sipunculid Sipunculus nudus هو مورد مصائد الأسماك الحاسمة كما أن لديها قيم غذائية وطبية عالية. حاليا ، فإن البحوث على البيولوجيا الجزيئية من Nudus Sipunculus لا تزال في مهدها. الغرض من هذه المقالة هو تطوير طريقة حساسة لتوطين مرنا محددة في السائل الكوليسي سيبونكولوس. يتضمن البروتوكول خطوات مفصلة من ISH ، بما في ذلك antisense المسمى digoxigenin وإعداد الريبوسبر بالإحساس ، وجمع السوائل الكيوموإعداد القسم ، وتهجين الريبوسوم المحدد ، واحتضان الأجسام المضادة ، والتلوين وعلاجات ما بعد التلوين. يتم عرض النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من تجربة ناجحة باستخدام هذه الطريقة. وينبغي أن ينطبق البروتوكول على أنواع سيفونكولا الأخرى أيضا.

ويرد موجز للخطوات التي تنطوي عليها ISH في الشكل 1. تم تصنيع Antisense والريبوسبر اتى للdmrt1 من منتجات PCR تضخيمها من cDNAs السائل coelomic. وتم التحقق من صحة منتجات الـ PCR عن طريق التسلسل المباشر. تم تصنيع Riboprobes باستخدام تي 7 RNA البوليميراز وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة وتقرير سابق4 مع بعض التعديلات الطفيفة. وترد الإشارات التمثيلية لـ ISH في الشكل 2. ISH من السائل الكولودوس السبّالي مع الريبوسبر المضاد للمنطق ا...

يصف هذا البروتوكول نهج التهجين في الموقع الفعال للكشف عن مستويات التعبير mRNA والأنماط المكانية للجينات المستهدفة في السائل الكوليسي.

في الموقع التهجين لسيبونكولوس nudus Coelomic السائل

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

في التهجين في الموقع هو تقنية مفيدة جدا لتقديم أنماط التعبير مررنا و IncRNA من جينات محددة في الأنسجة. هدفنا في هذه المقالة هو تطوير طريقة حساسة للكشف عن توطين مرنا محددة في السائل coelomic من نوكلوس Sipunculus، وهو مورد السمكية الحاسمة. لقد عرضنا النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من تجاربنا الناجحة باستخدام هذه الطريقة.ومن المؤمل أن يتم تطبيق طريقتنا على الأنواع الأخرى من Sipuncula لتحديد أنماط التعبير من مرنا وشركة RNA محددة في السائل coelomic. إصلاح الـ Sipunculus nudus على طاولة التشريح. فتح الجسم من nudus Sipunculus مع مقص autoclaved الصغيرة.ثم جمع ونقل السائل coelomic مع ماصة إلى بولي D-ليسين يعامل شرائح المجهر، وانتشار أقل ما يقال. الهواء الجافة الشرائح لمدة ساعة في 37 درجة مئوية. غسل الشرائح مع DEPC-PBS لمدة ثلاث مرات، خمس دقائق لكل غسل مع التحريض لطيف.استنزاف برنامج تلفزيوني، إضافة محلول البروتينات K على الشرائح لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنزاف محلول البروتينات K. أضف حل PFA على الشرائح لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.استنزاف حل PFA. غسل الشرائح مع DEPC-PBS لمدة ثلاث مرات، خمس دقائق لكل غسل مع التحريض لطيف. استنزاف برنامج تلفزيوني.إضافة 50 ميكرولتر ريبوبروب. إضافة غطاء. وضع الشرائح في مربع الرطب وختم جيدا مع فيلم البارافين.التهجين بين عشية وضحاها في 60 درجة مئوية. اغمر الشرائح في مخزن الغسيل واتركه قائماً حتى تنزلق الأغطية تلقائيًا. اغسل الشرائح مع عازلة الغسيل المُحمّى مسبقاً مرتين عند درجة 65 درجة مئوية، 30 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف.اغسل الشرائح بمحلول SSC المُحمّى مسبقًا مرتين بمعدل 65 درجة مئوية، و30 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. اغسل الشرائح بمحلول MABT مرتين في درجة حرارة الغرفة. 30 دقيقة لكل غسل مع التحريض لطيف.استنزاف MABT. إضافة المخزن المؤقت للحظر. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات.استنزاف العازلة حظر. إضافة الأجسام المضادة، احتضان الشرائح في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. استنزاف حل الأجسام المضادة.اغسل الشرائح بمحلول MABT لمدة أربع مرات، و25 دقيقة لكل غسل مع هياج لطيف. استنزاف MABT. إضافة العازلة فوسفاتيز القلوية لمدة ثلاث مرات، خمس دقائق لكل حضانة.إزالة العازلة فوسفاتاتيز القلوية. أضف حل تلطيخ BCIP-NBT. إبقاء الشرائح في الظلام.يختلف وقت التلطيخ من دقائق إلى ساعات، حتى خلال الليل، والذي يعتمد على شدة الإشارة. وينبغي التحقق من حالة تلطيخ أكثر تواترا في بداية تلطيخ. على سبيل المثال، مع فاصل زمني من عدة دقائق، وعدة ساعات على الأكثر من تلطيخ.وينبغي أن يكون وقت التدقيق قصيراً بقدر ما يمكن أن يكون لتجنب إدخال إشارات خلفية عالية بسبب التعرض للضوء. وتظهر الإشارات التمثيلية للتهجين في الموقع. في التهجين في الموقع من السائل النخاعي nudus coelomic مع ريبوبروفب المضادة للحس الذي يستهدف dmrt1 يشير إلى تلطيخ الأرجواني تتركز في الخلايا التروبوبلاست من spermatozeugmata، الشكل 2A وB.Sense ريبوبروفب ل dmrt1 لم يكشف أي إشارة التهجين، الشكل 2C.بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد جدا لكيفية تصور أنماط التعبير من الحمض النووي الريبي الهدف أو IncRNA في السائل coelomic من سيبو.

in-situ-hybridization-for-sipunculus-nudus-coelomic-fluid

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هنا ، نحن تصف كفاءة عالية...

إنتاجية عالية في الموقع أسلوب التهجين لتوصيف أنماط التعبير مرنا في الفأر الجنينية السفلى المسالك البولي التناسلي

من خلال الجمع بين أساليب جبل RNA...

RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في الأجنة جبل الجامعة وعلم الأنسجة الخلية مقتبس عن Elasmobranchs البحرية

أصبح الزرد، والأسماك الاستوائية الصغيرة، نموذجا محببا لدراسة وظيفة الجين خلال التنمية الفقاريات والمرض. التعبير الزماني والمكاني من الجينات المستهدفة يمكن تحديده من...

ارتفاع القرار جبل بأكمله<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين داخل الأجنة الزرد لدراسة التعبير الجيني وظيفة

الهدف من هذا البروتوكول هو تزويد المستخدمين بمجموعة من الطرق لفك المركبات عالية الإنتاجية لأجنة Lymnaea stagnalis واليرقات استعدادا للتهجين الكامل في الموقع ، وللعلاجات اللاحقة قبل وبعد التهجين.

ككل جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; طريقة التهجين لالبطني الأقدام الرخويات<em&gt; الراكدة المنقعية</em

نقدم هنا، بروتوكول مكانياً وزمنياً تقييم وجود الحجمية قابلة للتطبيق في الشجاعة التجزئة باستخدام نهج تعديل الجامعة-جبل تهجين في الموقع.

التصور الحجمية في الشجاعة القراد بالجامعة-جبل في الموقع التهجين

والهدف من هذا البروتوكول هو إجراء التهجين في الموقع على عينات المرجان الكبار التي تم تضمينها في البارافين ومقطوع على الشرائح الزجاجية. هذا أسلوب نوعية المستخدمة لتصور التعبير المكاني لإجراء تحقيق معنى المضادة الحمض النووي الريبي في الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين.

في الموقع تقنيات التهجين لعينات المرجان الكبار جزءا لا يتجزأ من البارافين

ويتيح هذا البروتوكول التصور للتعبير الجيني في الجنينية أستياناكس كافيفيش. وقد وضعت هذا النهج مع الهدف المتمثل في تعظيم إشارة تعبير الجينات، مع التقليل من تلوين الخلفية غير محددة.

ووليماونت في الموقع التهجين للأجنة أستياناكس

الحمار الوحشي هو نموذج مهم لفهم نمو الكلى. هنا ، يتم تحسين بروتوكول التهجين في الموقع للكشف عن التعبير الجيني في يرقات حمار وحشي والأحداث أثناء تطور الميكسونفروس.

في سيتو التهجين في يرقات حمار وحشي والأحداث خلال تطوير Mesonephros

غالبا ما ترتبط الميكروبات المعوية ، بما في ذلك البكتيريا خارج الخلية ومسببات الأمراض داخل الخلايا مثل فيروس أورساي والميكروسبوريديا (الفطريات) ، بالديدان الخيطية الخيطية البرية Caenorhabditis . تقدم هذه المقالة بروتوكولا للكشف عن الميكروبات التي تستعمر و / أو تصيب الديدان الخيطية C. elegans وقياسها ، ولقياس حمل مسببات الأمراض بعد العدوى الخاضعة للرقابة في المختبر.

التهجين الفلوري للحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) لتصور الاستعمار الميكروبي والعدوى في أمعاء Caenorhabditis elegans

يتم تحفيز الخلايا التائية و ILC2 المعبرة عن IL-9 أثناء عدوى N. brasiliensis ، ومع ذلك فقد تم التغاضي عن توصيفها إلى حد كبير في الأمعاء المصابة بسبب ترددها المنخفض وحركيتها التفاضلية. يصف هذا البروتوكول عزل هذه الخلايا عن الأعضاء المستهدفة المختلفة وتأكيد هويتها عن طريق قياس التدفق الخلوي في مراحل العدوى المختلفة.

استراتيجية لدراسة الخلايا اللمفاوية المنتجة ل IL-9 في نموذج عدوى Nippostrongylus brasiliensis

هنا ، نصف بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر Cladonema. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع مع علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، ويتيح وضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine تحديد الخلايا المتكاثرة. معا ، يمكن اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط.

التهجين الفلوري في الموقع ووضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine للخلايا الشبيهة بالجذعية في قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum

اكتشف طريقة التهجين الموضعي لتحليل توطين الرنا المرسال في السائل الخلطي لدى Sipunculus nudus. تتيح هذه التقنية تصور أنماط التعبير الجيني بدقة عالية في الكائنات البحرية.

في الموقع التهجين لسيبونكولوس nudus Coelomic السائل

استكشف المزيد من الفيديوهات