قياس سمية الببتيد RAN في C. elegans

إن الببتيدات ران هي سمة من سمات تكرار الاضطرابات العصبية مثل مرض هنتنغتون، والتصلب الجانبي الضموري، والخرف الجبهي الصدغي. وتوفر هذه البروتوكولات نهجاً معيارياً هاماً لقياس سمية الببتيد ران في نظام نموذج C.elegans. التقنيات الموصوفة بسيطة للتعلم وغير مكلفة ، ويمكن تنفيذها بسرعة ، والاستفادة من الميزات القابلة للتكرار لنظام C.elegans مثل الحركة والتكاثر.

عند محاولة هذا البروتوكول، التحدي الرئيسي هو الحصول على متسقة ران الببتيد سمية والتعبير. وتشمل العوامل الرئيسية للسيطرة على درجة حرارة المخدرات، وتوقيت التحولات درجة الحرارة وإعداد لوحات المقايسة. من المهم للمجربين لتصنيف باستمرار الأنماط الظاهرية للحيوانات في هذه العملية التي تعتمد على العمر.

عرض مرئي من هذه التقنية يظهر معايير التصنيف الخاصة بهم. تبدأ بصب الخيطية القياسية متوسطة النمو مع IPTG ملليمتر واحد و 25 ميكروغرام لكل ميليلتر كاربينسيلين في 24-جيدا لوحات. خط خارج RNAi تغذية المستنسخين في HT115 البكتيريا على LB كاربينيسيلين أجار وتنمو لهم في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي، واختيار مستعمرة واحدة في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام السائلة LB كاربينيسيلين وتنمو البكتيريا لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 250 دورة في الدقيقة. بقعة أربعة آبار فردية من RNAi NGM 24 جيدا لوحة مع 20 ميكرولترات من الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها كما هو موضح في مخطوطة النص والسماح للبكتيريا RNAi للحث على إنتاج الحمض النووي الريبي المزدوج بين عشية وضحاها. استخدام طريقة هيبوكلوريت القياسية لعزل البيض من يوم واحد الكبار C.elegans التعبير عن transtide RAN المتكاملة.

ثم بذور حوالي 30 بيضة في كل بئر من لوحة 24 جيدا واحتضان لوحة في 20 درجة مئوية لمدة سبعة أيام. لإجراء تحليل سرعة الفيديو، احصل على شريطي فيديو من بئرين منفصلين لكل حالة RNAi باستخدام مجهر ستيريو تشريح مزودة بكاميرا أحادية اللون. تأكد من استخدام إعدادات الاكتساب الثابتة بين الآبار.

لكل فيديو، قم بتعيين المدة لمدة 10 ثوانٍ والفاصل الزمني إلى 76 مللي ثانية. تعيين وقت تعرض الصورة إلى أربعة مللي ثانية واستخدم إعداد التكبير/التصغير 1.49. ثم حدد اثنين من قبل اثنين binning.

تحقق من دقة 800 في 600 بكسل وبدء التسجيل. بعد الاستحواذ، تسمية كل فيديو على الفور مع سلالة، شرط RNAi وعدد جيد. ثم قياس المسافة المقطوعة وطول كل ل 20 حيوانا مختلفا لكل فيديو، وفحص ما مجموعه حوالي 40 ديدان لكل حالة RNAi.

في البرنامج، حدد زر أدوات التعليق التوضيحي. ثم أداة النص التعادل. انقر على نقطة في وسط الدودة التي يتم قياسها في الإطار الأول من الفيديو ووضع علامة عليها برقم.

تقدم الفيديو إلى النهاية أثناء تتبع بصريا دودة. ثم انقر فوق عليه ووضع علامة عليه مع الرقم المقابل التالي. استخدم أداة شريط مقياس الرسم لرسم خط من الرقم الأول إلى الرقم الثاني وتسجيل المسافة المقطوعة في جدول البيانات.

كرر هذا القياس لـ 19 دودية أخرى في الفيديو مع الحفاظ على كل قياس فردي في نافذة التحليل. وبمجرد اكتمال القياسات، خذ لقطة من إطار الفيديو النهائي توضح جميع خطوط القياس بحيث يمكن تتبع البيانات إلى الحيوان الذي نشأت منه. بعد ذلك، تحليل البيانات باستخدام جدول بيانات أربعة أعمدة حيث العمود الأول هو معرف الفيروس المتنقل والعمود الثاني هو السرعة.

يمكن العثور على وقت كل فيديو عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الفيديو تحت التجربة والذهاب إلى الخصائص. لتطبيع قياس السرعة، العثور على طول كل. استخدام أداة رسم متعدد الخطوط لتتبع بحرية C.elegans من غيض من الرأس إلى طرف الذيل.

ثم تأخذ لقطة من إطار الفيديو النهائي توضيح جميع خطوط متعددة. وسيسجل طول الخطوط تحت الإحصاءات. إضافة عمودين إلى جدول البيانات، أحدهما لطول الحيوان والأعمدة للسرعة التي تم تسويتها.

وأخيراً، قم بتحليل بيانات السرعة التي تم تطبيعها باستخدام ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار ما بعد المخصص مقابل RNAi المتجهات الفارغة. مكان أربعة إلى ستة L4 C.elegans المعدلة وراثيا التعبير عن RAN الببتيد GFP على ستة سنتيمتر GFP RNAi لوحة وتنمو لهم في 20 درجة مئوية. إذا كانت التجربة تستخدم RNAi لاختبار الآثار الوراثية على سمية الببتيد RAN، نقل 10 البالغين gravid المعدلة وراثيا إلى كل من اثنين من ناقلات فارغة RNAi GFP RNAi أو الجينات الخاصة RNAi لوحات.

إذا كانت المسوخ تستخدم لتحليل الآثار الوراثية على سمية الببتيد RAN، ضع 10 نوع البرية جرافيد أو الحيوانات المتحولة التعبير عن نفس TRANSGENE RAN على كل من اثنين من ناقلات فارغة RNAi أو GFP RNAi لوحات. تنمو لهم في 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. اختيار 10 مجموعات من 10 L4s المعدلة وراثيا من لوحات RNAi ووضع كل مجموعة على لوحة RNAi سنتيمترية ثلاثة.

تأكد من أن الديدان المحددة للمسايسة كلها حركية طبيعية سطحية. ضع اللوحات في كيس بلاستيكي للاحتفاظ بالرطوبة واحتضانها عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، وتحليل الحيوانات للتنقل عن طريق التنصت على لوحات على المجهر تشريح والتحقق من الحركة.

إذا تحركت الدودة أكثر من طول الجسم، عدها على أنها متنقلة ونقلها إلى لوحة RNAi جديدة تبلغ ثلاثة سنتيمترات. استخدمي اختيار البلاتين للاستفادة من الديدان المتبقية على الرأس والذيل. إذا تحرك الحيوان أكثر من طول الجسم، عد الحيوان على أنه متنقل ونقله إلى لوحة RNAi جديدة لمدة ثلاثة سنتيمترات.

إذا لم يلاحظ شلل كبير في مكافحة ناقلات فارغة بحلول اليوم الثاني، وإنهاء الفحص والبدء من جديد. تجميع جميع الديدان غير المنتقلة معا بحيث يمكن بسهولة الكشف عن حركة أكثر من طول الجسم. عد جميع مشلولة، معبأة، أو الديدان الميتة والتخلص من لوحة.

مواصلة تسجيل الحيوانات للشلل كل يوم لمدة خمسة إلى سبعة أيام. تم استخدام قياس النمو لقياس تأثير الموانع الجينية على سمية DIPEptides RAN التي تم العثور عليها في المرضى ALS مع التوسع تكرار G4C2. أدى التعبير عن PR50 GFP وحده إلى اعتقال النمو الكامل ، ولكن الضربة القاضية للعديد من الجينات قمعت السمية التنموية.

تم قياس تأثير الضربات السريعة الجينية المحددة على الحركة التنموية للحيوانات المعبرة عن PR50 باستخدام طريقة تحليل سرعة الفيديو. وكما هو متوقع، أدى تثبيط تعبير PR50 GFP إلى زيادة كبيرة في الحركة مقارنة بالمتجه الفارغ RNAi. وعلاوة على ذلك، أدى RNAi ضد الوحدة الفرعية proteasome RPN7 إلى زيادة كبيرة في حركة PR50.

عندما تم تحليل الأنماط الظاهرية للبالغين مع مقايسة الشلل المعتمدة على العمر ، أظهر PR50 GFP شللًا يصل إلى 80٪ بحلول خمسة أيام من العمر. ومع ذلك، RNAi موجهة إلى الشلل الذي تأخر كثيراً في الشلل الجيني الذي تأخر كثيراً مما يشير إلى أن الـ cul-6 مطلوب لسمية PR50 GFP. لتحديد ما إذا كانت بروتينات RAN تسبب علم الأعصاب عندما يتم التعبير عنه في الخلايا العصبية C.elegans ، تم فحص السمية الخاصة بالخلايا العصبية باستخدام مقايسة commissure.

في اليوم الثاني من البالغين, PR50 GFP التعبير في الخلايا العصبية الحركية أدى إلى زيادة كبيرة في الخلايا العصبية الحركية blebbing. تم قمع هذا علم الأمراض العصبية بشكل كبير من قبل طفرة في مستقبلات الأنسولين IGF الجينات هومولوغ DAF-2 الذي يؤخر الخصائص السامة للعديد من البروتينات العصبية. بالنسبة للمقايسة السلوكية، من المهم أن تنتج الببتيدات RAN نمط ظاهري مخترق للغاية.

ويمكن لهذه الجينات أو الأدوية أن توفر مؤشرات بيولوجية جديدة أو خيارات علاجية لأمراض الببتيد ران. باستخدام هذه المقايسات، قمنا بإجراء شاشة RNAi على نطاق الجينوم لمثبطات C9ORF72 المرتبطة RAN الببتيد البرولين-أرجينين. الجينات التي تم تحديدها في هذه الشاشة تشمل العديد من الجينات الجديدة والمحفظة التي ستكون موضوع دراسات ميكانيكية في المستقبل.