عكس النسخ حلقة بوساطة Isothermal التضخيم (RT-LAMP) القول للكشف المحدد والسريع لفيروس بحيرة البلطي

فيروس بحيرة البلطي هو فيروس ناشئ ومسببات الأمراض المعدية، التي تسبب معدل وفيات عالية في البلطي وأنواعه الهجينة. وبما أن البلطي مصدر رئيسي للبروتين في العديد من البلدان النامية، فإن الإصابة الجديدة بالفيروس لها تأثير كبير على تربية السمك البلطي، كما أنها تهدد الأمن الغذائي العالمي. تطوير طريقة سريعة ودقيقة وحساسة للكشف عن الفيروس في أنسجة السمك، وسوف تساعد على السيطرة على المرض، والحد من تأثير الفيروس.

في هذا الفيديو، سوف نظهر التكرار العكسي loop-mediated التضخيم متساوي الحراري، أو اختبار RT-LAMP، للكشف السريع عن فيروس بحيرة البلطي في عينات الأسماك. الجزء الثاني، استخراج الحمض النووي الريبي. أولا، إضافة 3250 ملليغرام من أنسجة الكبد في أنبوب معقم 1.5 ملليلتر microcentrifuge، التي تحتوي على 600 إلى 1000 ميكرولتررز حمض guanidinium-الفينول قاعدة الكاشف، وmince حتى متجانسة.

جهاز طرد مركزي في 10،000 RCF لمدة 30 ثانية، ونقل فائقة إلى أنبوب جديد. إضافة حجم متساو من 95٪ الإيثانول إلى الأنبوب، واخلط جيدا. نقل الحل إلى عمود تدور، وضعت في أنبوب جمع، ثم الطرد المركزي في 10، 000 RCF لمدة 30 ثانية.

تجاهل التدفق من خلال، ونقل العمود إلى أنبوب جمع جديد. إضافة 400 ميكرولترات من RNA PreWash في العمود، والطرد المركزي في 10، 000 RCF لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق من خلال، وكرر هذه الخطوة.

أضف 700 ميكرولتر RNA غسيل العازلة في العمود، والطرد المركزي في 10،000 RCF لمدة دقيقتين. بعد ذلك، نقل العمود إلى أنبوب معقم 1.5 ملليلتر microcentrifuge. وأخيراً، فإن الحمض النووي الريبي في مصفوفة العمود مع 100 ميكرولتر، والمياه الخالية من النوى، والطرد المركزي في 10،000 RCF لمدة 30 ثانية.

الجزء الثالث، تصميم التمهيدي. وRedrExplorer الإصدار 4 هو الأداة الأكثر شيوعا للمعلوماتية الحيوية لتصميم مصباح كفاءة، أو الكتيبات RT-LAMP، التي تتوفر فيها أدلة جيدة للبرنامج على موقعه على الانترنت. هنا، تم تصميم أربعة التمهيديات المحددة، تتألف من اثنين من التمهيدية الداخلية واثنين من الخارج، للتعرف على ست مناطق متميزة في الجزء 3 من TiLV، نشأت من تايلاند.

بعد دخول الموقع، حيث يظهر الرابط في الفيديو، انقر على التمهيدي V4. اختر الملف الذي يحتوي على تسلسل الجزء 3 من TiLV، في تنسيق FASTA، استردادها من رقم الوصول إليها من قبل GenBank، KX631923، أو البلطي بحيرة فيروس TV1 الجزء 3، ثم انقر فوق زر تصميم التمهيدي. بمجرد النقر على زر إنشاء ، ستتم عملية البرنامج ، وستظهر النتائج. بعد تحسين تسلسل لتضخيم المصباح، في المجموع، تم اختيار زوج واحد من التمهيديات الخارجية، واثنين من أزواج من التمهيديات الداخلية، لهذه الدراسة، للكشف عن عدوى TiLV.

تظهر هذه المجموعة من الزواريع هنا. الجزء الرابع، مظاهرة من RT-مصباح. مزيج الرئيسي لRT-مصباح محددة لفيروس بحيرة البلطي، ويتألف من المواد الكيميائية التالية.

إعداد مزيج رئيسي باستخدام المواد الكيميائية المبينة في الجدول. الاستغناء عن 22 ميكرولترات من مزيج رئيسي في أنبوب معقم 1.5 ملليلتر microcentrifuge. ثم، إضافة ثلاثة ميكروليتر من قالب الحمض النووي الريبي في أنبوب التفاعل.

للسيطرة السلبية، واستخدام الماء المقطر بدلا من المواد RNA، واخلط جيدا. احتضان ردود الفعل في 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، تليها 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، يتم ملاحظة التغيرات الحرارية بصريًا من خلال العين المجردة.

حيثما كان ذلك مناسبا، يمكننا تأكيد نتائج اختبار RT-LAMP، من خلال إجراء جل الكهرباء على جل agarose 1.5٪، تعمل مع ثابت 100 فولت، لمدة 40 دقيقة، حيث يتم تحميل واحد كيلو بيس زوج- زوج الجزيئية الحجم سلم الحمض النووي على طول كعلامة لتحديد حجم جزء. الجزء الخامس، النتائج التمثيلية والتفسير. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، لوحظ رد فعل الفلورس الحبوب الذي يشير إلى التضخيم الإيجابي لـ TiLV في أنسجة الأسماك ، بوضوح في عينات مصابة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند طول موجة من 365 نانومتر ، في حين أن تلك التي تحكم سلبيًا كان لها حل واضح وغير ملون قليلاً.

وفي المقابل، تم تأكيد تضخيم منتجات RT-LAMP على الهروفيرسيس هلام agarose، والتي تظهر أحجام مختلفة من التضخيمات المتعددة من تكرار الحمض النووي المقلوب، وتشكيل هياكل حلقة جذعية تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية في العينات المصابة بتيلف، في حين لم يتم عرض أي نطاقات في آبار التحكم السلبي، حيث كانت النتائج وفقا لتلك التي من مقايسة RT-LAMP. لذلك ، للحد من انتشار فيروس بحيرة البلطي ، فإن الفحص الفوري لهذه الأسماك المصابة ، باستخدام طريقة تشخيصية فعالة ، هو أحد المفاتيح الهامة. لذلك، ينبغي أن تقدم مقايسة RT-LAMP المطورة حديثًا أداة تشخيص سريعة وحساسة يتم تطبيقها في عملية قياس الأمن البيولوجي.

ويمكن استخدام هذه التحاليل إما في المختبر أو في المرافق في الموقع. ونأمل أن يتم تنفيذ هذه الطريقة لفحص أعداد الأسماك المصابة التي يمكن أن تؤدي إلى الحد من انتشار فيروس بحيرة البلطي.