أساليب موحدة لقياس التعريفي من استجابة الصدمة الحرارية في الكينورهابيتس elegans

هنا، يتم تقديم بروتوكولات موحدة لتقييم تحريض استجابة الصدمة الحرارية (HSR) في الكينورهاب elegans باستخدام RT-qPCR على المستوى الجزيئي، المراسلين الفلورسنت على المستوى الخلوي، و ثيرمورcovery على مستوى الكائنات الحية.

استجابة الصدمة الحرارية هي مسار استجابة ضغط خلوي أساسي يحافظ على بروتيوستاسيس السيتوبلازمي ويمكن أن يتميز على المستويات الجزيئية والخلوية والكائنات الحية في elegans البحر. نقدم سلسلة من البروتوكولات الموحدة وأفضل الممارسات التي تولد تحريض قوي من استجابة الصدمة الحرارية في elegans البحر من أجل المساعدة في تعزيز قابلية التكاثر في مجال الاستجابة للصدمات الحرارية. نظهر أن التسامح الحراري، وهو مُعَدّة كائنات حية شائعة الاستخدام لا تعتمد على استجابة الصدمة الحرارية.

بدلا من ذلك، نوصي باستخدام الاسترداد الحراري، وهو مقايسة الكائنات الحية التي هي استجابة الصدمة الحرارية تعتمد. تصبح استجابة الصدمة الحرارية مخففة مع بداية وضع البيض. ولذلك، فإن توقيت النمو هو متغير حاسم يجب أن يؤخذ في الحسبان في تجارب الاستجابة للصدمات الحرارية.

تبدأ بإنشاء مجموعة دودة متزامنة. استخدم سلكًا بلاتيني لنقل ما يقرب من 10 ديدان بالغة gravid إلى طبق جديد. تأكد من إزالة أي بيض أو يرقة قد تكون قد نقلت مع البالغين.

السماح للدودة لوضع البيض لمدة ساعة واحدة، ثم إزالة البالغين من لوحة. الحفاظ على الديدان المتزامنة عند 20 درجة مئوية حتى مرحلة النمو المرغوب فيها ، مع الأخذ في الاعتبار أن توقيت النمو يختلف مع كل سلالة ودرجة الحرارة التي يتم فيها رفع الديدان. عندما تكون الديدان جاهزة لصدمة الحرارة، لف الأطباق بالأفلام البارافين واستخدم رف أنبوب اختبار مع وزن الرصاص لغمرها في حمام مائي متداول عند 33 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

استعادة لوحات من حمام الماء وتجفيفها بمنشفة ورقية. إزالة فيلم البارافين والسماح للدودة لاسترداد في 20 درجة مئوية لمدة ست إلى 24 ساعة، والتي ستكون وقتا كافيا لتوليف GFP. لإعداد الشرائح للتصوير، ضع شريحة مجهرية بين منزلتين أخريين تحتويان على شريط من شريط المختبر.

جعل حل agarose 3٪ في الماء وتسخينه في الميكروويف حتى يذوب agaroses. ثم استخدام ماصة ملليلتر واحد لوضع حوالي 150 ميكرولترات من agarose في وسط الشريحة. تغطية على الفور الشريحة مع شريحة فارغة، ووضعها عموديا بحيث تقع على شريط المختبر، ثم إزالته بعناية.

لشل حركة الديدان، إضافة قطرة صغيرة من levamisole ميليمولار واحد، عازلة M9، إلى وسط لوحة agarose ونقل 10 الديدان في قطرة باستخدام قطف الأسلاك البلاتينية. اختياريا، انتشار levamisole قبالة إلى خارج لوحة agarose ومحاذاة الديدان مع اختيار عندما تصبح مشلولة. تغطية الديدان مع زلة الغطاء وصورت لهم في أقرب وقت ممكن باستخدام المجهر المفلور.

لإجراء فحص thermorecovery، مزامنة الديدان والحفاظ عليها في 20 درجة مئوية حتى مرحلة النمو المطلوب. ثم الحرارة صدمة لهم لمدة ست ساعات. إزالة لوحات من حمام الماء والسماح لهم لاسترداد في 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

بعد الانتعاش، عد عدد الديدان التي يمكن أن تُجر مباشرة بعد التحفيز الميكانيكي دون حركة متشنجة أو شلل. لتصور الحرارة صدمة استجابة التعريفي على المستوى الخلوي، تم تحليل اثنين من سلالات البحر elegans مراسل الفلورسنت. في عينات التحكم السلبي دون صدمة حرارية، أظهر مراسل hsp-16.2 الفلورس التلقائي العادي، ولكن مراسل HSP-70 كان لديه الفلورانس التأسيسي في عضلة المثبط الشرجي.

بعد ساعة واحدة من الصدمة الحرارية ، لوحظ الفلوريس القوي في كلا الصحفيين عندما تم استخدام RNAi لهدم hsf-1 قبل قياس التعريفي الصحفي. وقد انخفضت الفلورانس من كل من السلالات بشكل حاد، مما يشير إلى أن هؤلاء المراسلين هم من Hsf-1 تعتمد. وكميات الحث من استجابة الصدمة الحرارية على المستوى الجزيئي، تم قياس اثنين من البروتينات صدمة الحرارة الأصلية مع RT PCR الرئيسية.

ووجد أن صدمة الحرارة لمدة ساعة 33 درجة مئوية تؤدي إلى زيادة أكثر من 2000 ضعف في التعبير النسبي عن جينات الصدمة الحرارية. وأظهر فحص thermorecovery أن التعرض لصدمة الحرارة لمدة ست ساعات أدى إلى انخفاض بنسبة 20٪ في الديدان مع حركة طبيعية بعد انتعاش 48 ساعة. تسببت الضربة القاضية لhsf-1 في انخفاض كبير في الحركة الطبيعية ، مع أكثر من 95 ٪ من الديدان التي تظهر حركة متشنج أو شلل بعد حثها.

في المقابل، لم يكن للانهضان من hsf-1 تأثير كبير على نتائج اختبار التسامح الحراري، حيث تتعرض الديدان لدرجة حرارة مستمرة 35 درجة مئوية ويتم قياس النسبة المئوية للديدان على قيد الحياة في نقاط زمنية مختلفة. عند تنفيذ هذه التقنية للمرة الأولى، تأكد من التفاف لوحات مع فيلم البارافين مرتين لمنع المياه من دخول لوحات وتدمير التجربة. يمكن توسيع التحاليل الجزيئية إلى التحليلات الجينومية باستخدام الحمض النووي الريبي (RNA-seq).

يمكن تضمين مقايسات الكائنات الحية الأخرى المتأثرة باستجابة الصدمة الحرارية ، مثل العمر الافتراضي. وقد أثبتت القدرة الفريدة لربط الجزيئية والخلوية ، والكائنات الحية الحرارة صدمة التحاليل في elegans البحر لا تقدر بثمن لفهم دور هذا المسار في التنمية والمرض.