مضاعفة في Electroporation الرحمية لاستهداف مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً

مضاعفة في كهربائي الرحم هو وسيلة قوية لدراسة الجوانب الهامة من الثدييات الكورتيوجينية مثل التفاعل بين الخلايا العصبية، ولدت في مواقع مختلفة والأعمار التنموية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على دراسة التفاعلات غير المُزاجَمة بين مجموعات الخلايا المختلفة هذه بطريقة سريعة ومفصلة وغير مكلفة. واحد الآثار اللافتة للنظر من طريقتنا هو أنه يسهل فهم أفضل لكيفية تغيير الأسلاك لدينا مماثلة في اضطرابات الخلايا العصبية مثل التوحد والفصام.

لا تقتصر هذه الدراسة على القشرة الجديدة ولكن يمكن استخدامها أيضًا لتحليل تفاعلات الخلايا إلى الخلية ، في مناطق exocortico مثل الـ sepalium أو المخيخ. واحدة من الخطوات الأكثر تحديا هو حقن الحمض النووي في البطينين الجانبي من الأجنة المبكرة. استخدام مصدر الضوء الساطع ضروري للحقن الناجح.

لكل عملية جراحية أولا إعداد 10 ميكرولتر حل يحتوي على ميكرولتر واحد من صبغة خضراء سريعة، واحد ميكروغرام لكل ميكرولتر حل الحمض النووي plasmid من الفائدة لكل plasmid، وحجم المناسبة على Endotoxin الحرة TE العازلة. وتحمّل مسبقًا ماصة زجاجية صغيرة مع محلول الحمض النووي المُعد المناسب. لأول مرة في جراحة الإلكترو الكهربائية الرحمية، ضعي مرهم على عيون فأرة الحمل المُخدرة في الوقت المناسب، واستخدمي شفرة حلاقة لحلاقة البطن.

تطهير الجلد المكشوف مرتين مع 70٪ مناديل الإيثانول واليود متسلسلة قبل المضي قدما مع شق على الجانب الأيمن من البطن. مرة واحدة في الرحم يمكن الوصول إليها استخدام ملقط الحلقية لاستخراج بعناية الجهاز. باستخدام أنبوب التعرق الذي يتم التحكم فيه في الفم، يحقن ما يقرب من 0.5 ميكرولترات من المحلول في البطين الجانبي لنصف الكرة الأيسر من أجنة E11.5 للاستراتيجية A.Or في البطين الجانبي لنصف الكرة الأيمن من الأجنة E13.5 للاستراتيجية B، حتى تظهر الصبغة الخضراء السريعة داخل البطين.

عندما تم حقن كل من الحل، مكان ملقط نوع الأقطاب البلاتينية حول الجانب الجانبي من رأس الأجنة حقن، مع القطب إيجابية موجهة إلى الجدار وسط لاستهداف تنح تنحدر القشرية للاستراتيجية A، أو موجهة إلى القشرة الجانبي للاستراتيجية باء، مع الحرص على تجنب القلب والمشيمة. استخدم أقطاب كهربائية على الموجة المربعة لتطبيق التسلسل المناسب من النبضات الكهربائية لكل عمر جنيني، كما هو مبين في الجدول. عندما تم حقن جميع الأجنة وكهربائها، استخدم ملقط لإعادة الرحم بعناية إلى تجويف البطن، وملء البطن مع المالحة الدافئة.

باستخدام إبرة خياطة 6-0، أغلق جدار البطن، وغلق بعناية شق الجلد. ثم العودة إلى قفص الحيوان المنزل مع رصد حتى الشفاء التام. بعد يومين من الجراحة الأولية، تأكد من أن الماوس يظهر سلوكًا طبيعيًا، ولا يظهر أي علامات على الألم أو الضيق.

قبل إعداد الحيوان للثاني في الكهربائي الرحمي كما أظهرت للتو. حقن 0.5 ميكرولترات من محلول الحمض النووي المطلوب في بطين الدماغ الجانبي الأيسر من الأجنة E13.5 للاستراتيجية A، وفي البطين الدماغ الجانبي الأيسر من الأجنة E15.5 لاستراتيجية B.After كل حقن، وضع الأقطاب مع القطب الإيجابي الموجه إلى القشرة الجانبية لنصف الكرة الأرضية حقن للاستراتيجية A واستراتيجية B.and electroporate embryos aseded in the table. عند الانتهاء من الإلكتروبور، قم بإعادة الرحم إلى تجويف البطن، وأكمل الجراحة والعناية بعد الجراحة كما هو موضح.

عند تنفيذ الاستراتيجية A، بعد أربعة أيام من الكهربة الثانية، حصاد الرحم من اليوم الجنيني 17.5 فأر أنثى حامل في طبق بتري من برنامج تلفزيوني على الجليد. واستخدام الملاقط لنقل الأجنة إلى طبق جديد من برنامج تلفزيوني تحت مجهر تشريح. باستخدام ملقط، فهم بعناية رأس كل جنين لتسهيل إزالة الجلد على الرأس والجمجمة.

استخدام ملقط أو ملعقة لرفع العقول المكشوفة. ثم استخدام ملعقة لنقل كل الدماغ إلى آبار فردية من 48 لوحة بئر تحتوي على حوالي 600 ميكرولترات من محلول المثبت في البئر. عندما تم جمع كل من العقول، إصلاح العقول في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها على شاكر المدارية، تليها ثلاثة يغسل عشر دقائق في برنامج تلفزيوني.

بعد الغسيل الأخير، تضمين العقول في 4٪ نقطة انصهار منخفضة agarose في برنامج تلفزيوني لمدة عشر دقائق تقريبا. بعد أن تتوطد agarose، استخدم الغراء سيانوكريلات لتأمين كل دماغ إلى جانب لمبة الشم حامل الأنسجة الهزاز حتى. ضع الحامل داخل حاوية الاهتزاز، وملء الحاوية مع برنامج تلفزيوني.

ثم استخدم الاهتزاز وفرشاة للحصول على 100 ميكرومتر سميكة أقسام تسلسلية التاجية. نقل ما يصل إلى سبعة أقسام في البئر وستة آبار لكل جنين، في لوحة جديدة 48 بئر تحتوي على 600 ميكرولترات لكل بئر من PBS الطازجة، وتستكمل مع المواد الحافظة المضادة للفطريات كما يتم جمعها. عندما تم الحصول على جميع المقاطع، استخدم فرشاة دقيقة لتركيب كل قسم على شريحة مجهر زجاجي، وتغطيتها بغطاء زجاجي لتقييم فعالية الكهربة على مجهر epifluorescence تستقيم.

عند تنفيذ الاستراتيجية B، في اليوم التالي للولادة 15، بعد التأكد من عدم الاستجابة لـ topinch، قم بتأمين الفأر في وضعية الوبين، واستخدم المقص لإجراء شق جلدي في منتصف الخط لفضح القفص الصدري والحجاب الحاجز، وقطع الحجاب الحاجز للوصول إلى القلب. باستخدام مقص غرامة، وجعل شق في الأذين الأيمن، واستخدام إبرة 25 غيج متصلة أنبوب مرنة لمضخة النزف ال peristaltic لاختراق البطين الأيسر. عندما تكون الإبرة في مكانها، تقدم ما لا يقل عن 25 ملليلتر من 4٪ شبه شكلي بواسطة التسريب عبر القلب، في تدفق مستمر عند 5.5 ملليلتر في الدقيقة.

بعد ما يقرب من خمس دقائق، ووقف الضخ، واستخدام مقص لإزالة الجلد على رأسه. إزالة الجمجمة، واستخدام ملعقة لإزالة أنسجة الدماغ. وضع الدماغ في بئر واحدة من 24 لوحة بئر تحتوي على 1.5 ملليلتر من 4٪ paraformaldehyde الطازجة, لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على شاكر المدارية.

ثم الحصول على 40 أقسام ميكرومتر من أدمغة ما بعد الولادة كما هو موضح للتو. بالنسبة لتصوير شريحة الدماغ الجنينية وما بعد الولادة، ضع الشرائح التي تحتوي على أقسام الدماغ المثبتة ذات الاهتمام على حامل شريحة المجهر. إدخال حامل المنزلق في المجهر confocal، واختيار القناة المناسبة لفلوروفلورس المستخدمة في التجربة.

قم بإجراء مسح عينة للحصول على صور الخريطة لكل قسم في الدماغ في أطوال موجية مختلفة للحصول على عرض عام لإخراج الإلكتروبورات المزدوجة. بمجرد الانتهاء، حدد عدسة 10x، في وضع مراقبة انقضاء الوقت Z-المكدس متعدد المساحة. في كل من مناطق XY المحددة، قم بتعيين محيطات التصوير المناسبة وكذلك عمق المسح الضوئي على طول محور Z وفقًا ل طائرات العينة، التي يكون فيها الفلوريسين مرئيًا.

الحصول على صور التكبير منخفضة من جميع المناطق المختارة، وتصدير الصور من تنسيق المنظمة الدولية للIF إلى TIFF في برنامج عارض المجهر. ثم حدد عدسة 60x، والتقاط صور التكبير عالية كما هو موضح للتو، لمراقبة التفاعلات من خلية إلى خلية على مستوى أكثر تفصيلا. الفجوة الزمنية بين مزدوجة في عمليات جراحية القطب الرحم يسمح الخلايا CAG إلى الخلايا المستهدفة في اليوم الجنيني 11.5 في أحد أماكن المنشأ للوصول إلى المنطقة الهامشية من القشرة الجديدة الجانبي بما في ذلك منطقة somatosensory، في الوقت المناسب لإقامة اتصالات مع الخلايا العصبية الإسقاط القشرية، وصفت في اليوم الجنيني 13.5.

العمليات الرائدة في الخلايا العصبية الإسقاط التعبير عن تعزيز GFP uprise بغزارة في المنطقة الهامشية من القشرة، والاختلاط مع عمليات M-الكرز التعبير عن الخلايا الكاتاريزية. في الكهربائي الرحمي في يوم الجنين 13.5، وذلك باستخدام BFP التعبير عن البلازميد يسهل وضع العلامات من الخلايا العصبية الإسقاط عبر طبقات القشرية المختلفة. والكهرباء الثانية في الجانب اللاتيني من اليوم الجنيني 15.5 يستهدف الطبقة العليا إسقاط الخلايا العصبية الفرعية، ولكن ليس الخلايا العصبية إسقاط الطبقة السفلى التي تتطور في مراحل سابقة.

الطبقة العليا الخلايا العصبية المستهدفة توسيع محاورها إلى نصف الكرة الأرضية contralateral، مع نمط ال arborization مميزة. التكبير عالية يسمح تصور أكثر تفصيلا من محور محور المحور callosal innervation من الخلايا العصبية الإسقاط المستهدفة داخل نصف الكرة الأرضية contralateral. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم أن تخطط توقيت الكهربائي، ونصف الكرة لحقن، وموقف الأقطاب الكهربائية وفقا للسكان الخلية التي سيتم استهدافها.

بعد هذا إجراء كلّ الطرق, مثل كهربائيّة واحدة ممتعة. يمكن القيام به لكلا النوعين من الخلايا لدراسة التعديلات الدائرة ممكن في الجسم الحي. باستخدام هذه التقنية، من الممكن دراسة التفاعلات الدقيقة بين خليتين مستهدفتين مختلفتين.

بما في ذلك المعلومات العلمية الجديدة في الجسم الحي، عن طريق كهربائي من البروتينات متشابك الفلورسنت.