تحديد كمية بشرية فيروس نوروفيروس مثل الجسيمات ملزمة لبكتيريا كومينسال باستخدام تدفق قياس الخلايا

الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد كمية ملزمة من الممرض eukaryotic فيروس النورو البشري للبكتيريا. بعد إجراء قياس أولي لارتباط بكتيريا الفيروسات ، يتم استخدام قياس الخلايا للتدفق للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالفيروسات داخل السكان.

التفاعلات بين الفيروسات والبكتيرية يمكن أن تكون مهمة للعدوى الفيروسية الناجحة وتحفيز استجابة مناعية للمضيف. ولكن في الوقت الراهن، لا يمكن إنتاج مخزون عالي التركيز ومنقى من فيروس نورو البشري في المختبر. ويمكن استخدام هذه التقنية مع أي فيروس يرتبط بالبكتيريا، والتي تتوفر لها إما جزيئات تشبه الفيروس أو فيروس حي.

فهو يمكننا من قياس التفاعلات بين هذه الفيروسات والبكتيريا. تلقيح خمسة ملليلتر من المتوسطة السائلة مع مستعمرة معزولة واحدة من كلواكا Enterobacter من لوحة أجار مباشرة من مخزون الجلسرين المجمدة. زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها.

وفي اليوم التالي، نقل 1.3 ملليلتر من الزّار من الاستزراع إلى أنبوبين منفصلين للطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنابيب في 10، 000 x ز لمدة خمس دقائق. إزالة االنبات، ثم غسل العينات مرتين باستخدام ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني معقم 1X لكل غسل.

أجهزة الطرد المركزي العينات مرة أخرى في 10، 000 x ز لمدة خمس دقائق. إزالة افرنح و resuspend بيليه في 1.3 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X العقيمة. بدءا من 0.5 ملليلتر من الثقافة غسلها، وتمييع بشكل متسلسل البكتيريا في 1X PBS من 10 إلى ناقص واحد إلى 10 إلى أربعة ناقص.

باستخدام مقياس الطيف، وقياس الكثافة البصرية من الثقافة غير المخفف غسلها وكل من التخفيفات الأربعة في 600 نانومتر. أداء 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية في 1X PBS لكل من التخفيفات السابقة. انتشار 100 ميكرولترات من التخفيفات الثلاثة الأخيرة لكل سلسلة على لوحات أجار لتحديد عدد وحدات تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر لكل عينة.

السماح للألواح لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. عكس لوحات واحتضان لهم في الحاضنة. بعد إعداد الكواشف والأجسام المضادة والبكتيريا كما هو موضح في المخطوطة، قم بتجميع جميع المواد في خزانة السلامة البيولوجية BSL-2.

يتم سرد الجسيمات الشبيهة بالفيروسات لفيروس النورو البشري كمسببات للأمراض BSL-2 وينبغي إجراء جميع الأعمال التي تؤدي باستخدام VLP في خزانة السلامة البيولوجية المعتمدة. إضافة 10 ميكروغرام من VLPs نوروفيروس الإنسان إلى كل أنبوب من البكتيريا وخلطها جيدا عن طريق الأنابيب. احتضان الأنابيب لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية مع دوران مستمر.

بعد الحضانة، الطرد المركزي الأنابيب في 10، 000 × ز لمدة خمس دقائق. التعرق والتخلص من افرا و resuspend بيليه البكتيرية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. بعد تكرار خطوات الغسيل مرة واحدة، الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى في 10، 000 X ز لمدة خمس دقائق.

تجاهل supernatant و resuspend بيليه VLP البكتيريا في 150 ميكرولترات من 5٪ حظر العازلة. خطأ شائع يحدث هو أن يتم تبديل الأنابيب وإضافة العلاج الخاطئ. لمنع ذلك، وترتيب جميع الأنابيب في الخطوط التي تتوافق مع العلاج الصحيح وإضافة علاج واحد في كل مرة إلى الأنابيب.

لكل عينة بكتيرية، إعداد 50 ميكرولترات من الجسم المضاد GII نوروفيروس الإنسان المخفف. باستخدام 5٪ العازلة، وتمييع الجسم المضاد واحد إلى 125 لعينات E.cloacae. إعداد 50 ميكرولترات من الجسم المضاد ايزوتيبي المخفف لكل عينة بكتيرية باستخدام نفس نسب التخفيف.

قم بتقسيم كل عينة من عينات المقايسة الخاصة بالمرفق إلى 350 ميكرولتر أكوت عن طريق نقلها إلى أنابيب طرد مركزي نظيفة سعة 1.5 ملليلتر. لإنشاء عناصر تحكم غير ملوثة، أضف 50 ميكرولترات من العازلة العازلة للحظر إلى أول aliquot من كل عينة بكتيرية. للعينات الملطخة، إضافة 50 ميكرولترات من التخفيف من الجسم المضاد GII إلى المجموعة الثانية من aliquots.

إنشاء عناصر تحكم isotype عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من الجسم المضاد isotype المخفف إلى المجموعة الثالثة من aliquots. احتضان جميع العينات على الجليد وفي الظلام لمدة 30 دقيقة. ثم الطرد المركزي جميع العينات في 10، 000 X ز لمدة خمس دقائق.

تجاهل supernatants وإعادة تعليق كل عينة في 150 ميكرولترات من FCSB. مرة أخرى، الطرد المركزي جميع العينات في 10، 000 X ز لمدة خمس دقائق. مرة أخرى، والتخلص من االهامات وإعادة تعليق العينات في 100 ميكرولترات من FCSB.

بعد الطرد المركزي للعينات مرة واحدة في نهاية المطاف والتخلص من المواد الخارقة، resuspend العينات في 150 ميكرولترات من FCSB. نقل كل عينة إلى أنبوب يحتوي على 400 ميكرولترات من FCSB لحجم إجمالي 550 ميكرولترات. تخزين العينات في 4 درجة مئوية حتى يتم تحليلها عن طريق تدفق القياسات.

تم قياس مرفق VLP باستخدام عملية استئصال التدفق. أولاً، استُخدمت قطع الكثافة لإخراج الحطام الخلوي، ثم تلتها عملية الإغراق اللاحقة في الأراضي النقطية لإزالة الازدواجية البكتيرية والكتل الخلوية. تظهر مخططات التكرار التمثيلي نقص إشارة PE في العينات البكتيرية فقط وتحول في كثافة إشارة PE في عينات VLP:bacterium مقارنة بعناصر التحكم غير المُطَهَقة والأيزوتيبي.

بعد ساعة واحدة من الحضانة مع 10 ميكروغرام من VLP، اكتشاف تدفق cytometry الجسيمات ملزمة لكل من E.colacae و L.gasseri. لتحديد الحد من القياس الكمي الملزم لهذه الحسبة ، تم إنشاء سلسلة من تخفيف VLPs قبل إضافة إلى البكتيريا. أدى انخفاض في كمية VLP في تخفيضات المقابلة للبكتيريا في المئة ملزمة VLP.

معرفة نسبة الفيروس:bacterium والحفاظ على نسبة متسقة بين التجارب مهم في تفسير النتائج. يمكن توليد طفرات بكتيرية وفيروسية لتحديد الهياكل السطحية الميكروبية التي تتوسط هذا التفاعل. هذه التقنية تسمح للباحثين بالإجابة على الأسئلة المتعلقة بالظروف والظروف التي تؤثر على التفاعلات البكتيرية في الفيروسة، بما في ذلك كيفية تغيير التغييرات في النمط الجيني للفيروسات، وظروف النمو البكتيرية، والتغيرات في الهياكل السطحية البكتيرية تغيير الربط الفيروسي.