منصة مختبر على رقاقة لتحفيز العظام Mechanotransduction وتحليل النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام

هنا نقدم بروتوكولات استزراع خلايا العظام داخل منصة مختبر على رقاقة قابلة للتكيف. يمكن استخدام هذه التقنيات لزيادة فهمنا للآليات التي تنظم إعادة عرض العظام المستحثة ميكانيكياً. يسمح نظامنا باستزراع خلايا العظام على المدى الطويل، مما يتيح التحديد الكمي المباشر لتكوين العظام وتفككها استجابة لبيئات التحميل الميكانيكية المتغيرة.

يمكن أن يؤدي استخدام هذه التقنيات الأساسية إلى اكتشافات تمتد إلى عدد من القضايا المتعلقة بالعظم مثل هشاشة العظام ، وشفاء الكسور ، وتحلل العظام في النخاع. لإنشاء طبقة البئر و microchannel ، الجمع بين بوليومير PDMS وعامل المعالجة بنسبة 10 إلى واحد في كوب من البلاستيك ومزيج بقوة ، ثم ديغا البوليمر لمدة 30 دقيقة. صب ببطء الخليط على قناع قبل التسوية المناسبة.

اتركه لمدة 30 دقيقة ويخبز في درجة حرارة 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. تخفيف حواف PDMS مع ملعقة مختبر مدبب وقشر بعناية بعيدا عن القناع، ثم قطع رقائق الفردية مع مشرط ونموذج 3D المطبوعة وسطح تنظيفها مع شريط التعبئة والتغليف. لجعل طبقة غشاء PDMS، كرر الخطوات السابقة لخلط، صب، والخبز في PDMS.

إزالة ورقة PDMS من مربع التسوية وقطع الأغشية الفردية التي تتطابق مع أبعاد طبقة البئر وmicrochannel. استخدام الفرجار لقياس سمك الغشاء في المركز والتخلص من أي الأغشية التي هي خارج سمك المطلوب، ثم تنظيف الأغشية بعناية مع شريط التعبئة والتغليف ووضعها على قطعة من فيلم البارافين. لجعل طبقة غطاء PDMS، كرر الخطوات السابقة لخلط وصب وخبز PDMS.

بعد قطع الأغطية الفردية إلى الحجم، ثقب الوصول لكمة من خلال PDMS مع لكمة خزعة ملليمتر واحد ثم سطح تنظيفها مع شريط التعبئة والتغليف. قم بتنشيط أسطح الطبقات الأولى والثانية باستخدام منظف البلازما لمدة 30 ثانية على إعداد طاقة تردد الراديو المتوسط، ثم قم بمحاذاة فتحات الوصول في الطبقة الأولى مع القنوات الدقيقة في الطبقة الثانية واضغط بقوة على الطبقتين معًا. لتصميم البئر العميق، كرر هذه العملية مع الطبقات اثنين وثلاثة باستخدام الشريط على الوجهين لإرفاق فيلم البارافين من طبقة ثلاثة إلى سطح مستو أثناء معالجة البلازما.

تقليم قبالة المواد الزائدة من غشاء PDMS وقشر بعناية بعيدا ورقة من فيلم البارافين من الجزء السفلي من رقاقة. خبز رقاقة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لزيادة قوة السندات بين طبقات PDMS، ثم إدراج زاوية الاستغناء عن نصائح في ثقوب الوصول في الغطاء وتأمين لهم مع الايبوكسي جزءين باستخدام تلميح micropipette لتطبيق الايبوكسي حول كل طرف. بعد الشفاء تماما الايبوكسي، سطح تنظيف رقاقة مع 70٪ الإيثانول ونقلها إلى مجلس الوزراء السلامة الحيوية.

توصيل حقنة خمسة ملليلتر إلى نصائح الاستغناء مع أنابيب السيليكون العقيمة وملء رقاقة كاملة مع 70٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية على الأقل. إزالة الإيثانول من رقاقة وتعقيمه مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، اغسل الرقاقة ثلاث مرات بالماء المقطر، واملأها بالماء، وأزل الأنابيب من نصائح الاستغناء.

احتضان الرقاقة لمدة 48 ساعة على الأقل في 37 درجة مئوية. ضع ربيع ضغط حول رمح الصفيحة وأدخله في الفتحة المركزية في الجزء السفلي من القاعدة ، ثم قم بتوصيل كتلة الطلب إلى أسفل القاعدة مع أربعة مسامير ذاتية التنصت. ضع ينبوع ضغط الثاني حول المسمار المركزي.

أدخل المسمار في الفتحة ذات الشكل السداسي في الجزء السفلي من الطلب وبرغي التجميع في الفتحة المترابطة في وسط كتلة الطلب. المسمار أربعة مواجهات بين الذكور والإناث في الجزء السفلي من القاعدة. إزالة الركود من الجهاز عن طريق تحويل الطلب عكس عقارب الساعة حتى أعلى من مطلي تحت الجزء العلوي من القاعدة، ثم ببطء بدوره الطلب في اتجاه عقارب الساعة حتى أعلى من لوحة هو مستوى مع أعلى القاعدة.

استخدام حقنة خمسة ملليلتر لإزالة الماء من رقاقة البئر العميق ومعطف الجزء السفلي من البئر مع 200 ميكرولترات من الكولاجين من النوع الأول في حمض الخليك لمدة ساعة. شطف رقاقة ثلاث مرات باستخدام DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم ووضعها في حامل رقاقة. بذور رقاقة مع MLO-Y4 osteocytes في MEM ألفا المتوسطة تكملها مصل العجل, FBS, والبنسلين / ستريبتوميسين.

إزالة الأنابيب من نصائح الاستغناء، ووضع رقاقة في طبق ثقافة البئر العميق، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. بعد الحضانة، إرفاق أنابيب معقمة إلى نصائح الاستغناء واستخدام حقنة خمسة ملليلتر لإزالة المتوسطة الثقافة المستهلكة من رقاقة، ثم إعادة ملء ببطء رقاقة مع المتوسطة الطازجة. ضع حامل الشريحة في الداخل المستطيل على الجزء العلوي من قاعدة جهاز التحميل، واطعم الأنابيب من خلال الفتحات الموجودة على الغطاء، واضمن الغطاء إلى القاعدة.

تطبيق تحميل على الخلايا عن طريق تحويل الطلب في اتجاه عقارب الساعة حتى يتم الوصول إلى إزاحة الصفائح المطلوبة، ثم ضع جهاز التحميل في صندوق تلميح p1000 micropette فارغة واحتضان الخلايا مع الحمل لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة، وإزالة الحمل من الخلايا عن طريق تحويل الطلب عكس عقارب الساعة إلى موقف البداية الأصلي، ثم إزالة الغطاء من الجهاز، ووضع حامل رقاقة في لوحة ثقافة البئر العميق، واحتضان الخلايا لفترة استعادة الحمل بعد 90 دقيقة. استخدام حقنة خمسة ملليلتر لإزالة المتوسطة مكيفة من رقاقة وإزالة رقاقة من حامل رقاقة، ثم استخدام ملعقة مدببة لكسر السندات بين غطاء PDMS وطبقة جيدا.

الخلايا جاهزة الآن للتحليل ويمكن استخدام تكوين بئر الضحلة لتحليل النشاط الوظيفي من العظام والعظام. تم تحديد كمية تكوين العظام من preosteoblasts باستخدام البقع الحمراء واللازارين فون كوسا.

تم قياس إعادة الامتصاص العظمي من العظام باستخدام التولويدين الأزرق تلطيخ والمجهر الإلكتروني المسح الضوئي تم استخدامه للتحقق من وجود حفر resorption. تم استخدام تكوين رقاقة البئر العميق للحث على ميكانيكا العظام عن طريق تمديد الخلايا عبر ثابت من تمدد الطائرة. صور من العظام البذور في رقائق تثبت أن حضانة 48 ساعة من رقاقة مع الماء المقطر أمر بالغ الأهمية للحفاظ على صلاحية الخلية في مورفولوجيا نموذجية.

خلال نوبات التحميل، تعرضت الخلايا العظمية لتدرج سلالة مستحثة على غشاء PDMS. وحُددت العلاقة بين متوسط المكافئ للسلالات وازداح الصفائح بالنسبة للقيم بين مليمتر واثنين من المليمترات، وتم إنشاء خريطة حرارة تمثيلية للسلالات المستحثة. بعد التحميل، تم تحليل صلاحية الخلية مع تلطيخ dehydrogenase اللاكتات والمرفق الخامس ومقايسة الخلية الميتة.

Lactate dehydrogenase وصمة عار من osteocytes امتدت أظهرت أخف تلطيخ بالقرب من الحافة الخارجية من البئر، والذي يتوافق مع موقع قيم سلالات أعلى. توفر منصتنا درجة عالية من التنوع ويمكن استخدامها للتحقيق في مجموعة متنوعة من العوامل التي تنظم إعادة عرض العظام مثل الميكانو ترانساتوندوكشن الناجم عن الحمل، والالتهاب، وآثار المخدرات. توفر التقنيات المعروضة هنا أساسًا لتطوير عضو عظمي حقيقي على رقاقة يمكن أن تعزز فهمنا بشكل كبير للتعقيدات المتعددة الخلايا التي تنظم صحة العظام.