التصوير ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية اللمفية الفقارية والصرف باستخدام iDISCO+ والمجهر الفلوري ورقة الضوء
مايو 22, 2020
يتم تقديم بروتوكول يجمع بين إزالة الأنسجة مع المجهر الفلوري ورقة الضوء (LSFM) للحصول على صور ثلاثية الأبعاد والخلوية دقة الأوعية اللمفاوية والعقد الليمفاوية (LNs) جمع السائل النخاعي (CSF) والسوائل فوق الجافية الشوكي.
يوفر بروتوكولنا إطلالات ثلاثية الأبعاد وواسعة النطاق لأوعية الغدد اللمفاوية الفقارية والعقد اللمفاوية المستنزفة ، مما يسهل دراسة التصريف اللمفاوي وحركة مرور الخلايا المناعية اللمفاوية. يحافظ بروتوكول iDISCO+clearing على سلامة الأنسجة، مما يسمح بتعريب الخلايا العصبية والأوعية الدموية والمناعة في العمود الفقري، بما في ذلك الحبل الشوكي وال السحايات والمساحة فوق الجافية واستنزاف الغدد الليمفاوية. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس في تخدير 8 إلى 12 ماوس من العمر أسبوع، ضع الماوس في إطار stereotaxic.
واستخدام مشرط لإجراء شق الجلد في المنطقة المناسبة للحقن المخطط لها. استخدام محول العمود الفقري لشل الحبل الشوكي في Th12-L1 مستوى الفقرات وحاد تشريح العضلات paracervical أو طفيلي تغطي الرقبة والعمود لتصور سطح ماطر دورا. ثم استخدام إبرة قياس 26 لتخلل بعناية في المنطقة المركزية من ماطر دورا وتحت وضع arachnoid.
بعد ذلك، قطع مليمترين من طرف شعري زجاجي وربط الشعيرات الدموية بقنب مرتبط بحقنة 10 ميكرولتر. تحميل الشعيرات الدموية الصغيرة مع اثنين إلى ثمانية ميكرولترات من التتبع الفلورسنت من الاختيار. وإدخال شعري صغير في المنطقة الوسطى من ماطر دورا في الزاوية المناسبة للحقن المخطط لها.
دفع الشعيرات الدموية 1.5 ملليمتر تحت ماطر دورا، وإغلاق شق حول الشعرية مع 10 ميكرولترات من الغراء الجراحية. عندما يجف الغراء حقن ببطء التتبع الفلورسنت بمعدل ميكرولتر واحد في الدقيقة الواحدة. عندما تم تسليم وحدة التخزين بأكمله ترك الشعيرية في مكان لمدة دقيقة واحدة قبل سحب الشعرية الصغيرة.
وإغلاق ثقب الحقن مع الغراء إضافية. عند نقطة الوقت المناسبة بعد الحقن استخدام مقص تشريح لجعل الجلد والشقوق الصفاقية من أسفل البطن إلى القفص الصدري. افتح القفص الصدري للوصول إلى القلب وأدخل إبرة قياس 26 في البطين الأيسر للقلب.
Perfuse مع 20 ملليلتر من الجليد البارد 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني، بمعدل ملليلتر اثنين في الدقيقة. واستخدام مقص لقطع بسرعة الأذين الأيمن الإفراج عن تيار السائل في الذن. استخدام ملقط لإزالة الجلد تماما وإزالة أطرافه مع مقص.
إزالة جميع الأعضاء الداخلية، مع الحرص على ترك العقد الليمفاوية سليمة وقطع الأضلاع. غمر الأنسجة تشريح في الجليد البارد 4٪ paraformaldehyde في PBS في أنابيب 50 ملليلتر الفردية بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية، قبل غسل الأنسجة الثابتة ثلاث مرات في 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد، لمدة خمس دقائق لكل غسل. ل iDISCO + وضع العلامات من عينات جبل كامل أولا، وتجفيف الأنسجة مع الغمر المتعاقبة في تركيزات تصاعدية من الميثانول في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة لكل غمر مع الانفعالات في درجة حرارة الغرفة.
بعد الغمر الأخير احتضان العينات في الميثانول 33٪، 66٪ محلول ثنائي كلورو الميثان بين عشية وضحاها مع الانفعالات. في صباح اليوم التالي، غسل العينات مرتين مع 100٪ الميثانول لمدة ساعة واحدة لكل غسل في درجة حرارة الغرفة. تليها حضانة بين عشية وضحاها في بيروكسيد الهيدروجين 5٪ في الميثانول في أربع درجات مئوية.
في صباح اليوم التالي إعادة هيدرات العينات تدريجيا في الغمر المتتالية في تركيزات تنازلية من الميثانول في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة لكل تركيز مع التحريض في درجة حرارة الغرفة. لتجميل الفقرات تجمّن العينات في محلول مورس لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تليها اثنين من الشطف في برنامج تلفزيوني واثنين، حضانات لمدة ساعة واحدة، في 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، مع التحريض في درجة حرارة الغرفة.
بعد حضانة Triton X-100 الثانية، تعاملي مع العينات بمحلول التجوّل لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. تليها حضانة 24 ساعة في منع الحل في 37 درجة مئوية. في نهاية التسمية حظر محلول الحضانة العينات مع الأجسام المضادة الأولية، المخفف في 0.2٪ توين-20 و 0.1٪ الهيبارين في برنامج تلفزيوني تكمل مع 5٪ ثنائي الفينيل السلفوكسيد و 3٪ حل مصل الحمير في 37 درجة مئوية لمدة ستة أيام.
في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع أربعة إلى خمسة حضانات بين عشية وضحاها في الطازجة 2٪ Tween-20 و 0.1٪ الهيبارين في برنامج تلفزيوني لكل غسل في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات. ثم احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية وفقا لتوجيهات المخطوطات. بعد الغسيل الأخير يجفف عينات مع الغمر المتعاقبة في تركيزات تصاعدية من الميثانول في PBS لمدة ساعة واحدة لكل تركيز.
تليها حضانة بين عشية وضحاها في 33٪ الميثانول 66٪ محلول ثنائي كلورو الميثان. في صباح اليوم التالي، يغسل العينات مع اثنين من 15 دقيقة الديكلوروميثان يغسل. ومسح العينات في الإثير dibenzyl دون أن تهتز لمدة أربع ساعات.
للتصوير المجهري للوراء ورقة المنظار مكان العينات مسح في طائرة عرضية في مرحلة المجهر تحت 4X، 0.3 الهدف. وحدد على جانب واحد ثلاثة ورقة التكوين القضاء مع موقف X ثابت دون التركيز الديناميكي. استخدم ليزر LED ضبطها على 561 نانومتر و 100 مللي وات و 639 نانومتر و 70 مللي واط.
وتعيين الفتحة الرقمية ورقة الضوء إلى 0.03. تعيين مرشحات الانبعاثات المناسبة وملء غرفة المجهر مع الأثير dibenzyl. بعد ذلك، استخدم الكاميرا للحصول على أكوام مع 2.5 ميكرومتر Z و 30 ميلي ثانية وقت التعرض لكل خطوة باستخدام اثنين X زووم بصري و 0.8 ميكرومتر لكل بكسل.
وتنفيذ عمليات الاستحواذ الفسيفساء مع تداخل 10٪ على الإطار الكامل. الحصول على الصور في شكل TIF وتحويلها إلى تنسيق 3D مع برنامج برنامج التحويل الكامل المناسب. لإعادة بناء الفسيفساء الاستحواذ مع برنامج Stitcher فتح الصور وترتيب الصور يدويا لإعادة تشكيل الصورة كاملة الفسيفساء، وذلك باستخدام 10٪ تداخل بين الصور كدليل.
ثم استخدام برنامج 3D لتوليد الإسقاطات متعامد من البيانات. إضافة سمة رمز اللون إلى الأوعية اللمفاوية والهياكل التشريحية الأخرى المعروضة. ووضع تصحيح غاما من 1.47 إلى البيانات الخام التي تم الحصول عليها من المجهر الفلورية ورقة الضوء.
وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مزيج من iDISCO + مع ضوء ورقة المجهر الفلورسي يحافظ على تشريح العمود الفقري ويسمح التقاط الأوعية الدموية الليمفاوية داخل العظام المحيطة بها، والأربطة، والعضلات والعصابات. حقن التتبع الفلورسنت الأحمر صغيرة إما في السائل الشوكي الدماغي، وماغنا سيسترنا أو منطقة الصدر من الحبل الشوكي النتائج في تراكم التتبع داخل العقد الليمفاوية عنق الرحم العميق 45 دقيقة بعد الحقن، مما يدل على امتصاص وتصريف من التتبع من قبل الجهاز اللمفاوي.
حقن التتبع في البارنشيما الشوكي الصدري ينتج تراكم التتبع داخل أنسجة الحبل الشوكي والعقد الليمفاوية العميقة في عنق الرحم، ولكن ليس في الأوعية اللمفاوية اللمفاوية الصدرية والصدرية التي تحمل أجسامًا مضادة لمضادات LYVE-1. حقن المضادة ل-LYVE في نتائج البارينشيما الشوكي الصدري في وضع العلامات على كل من اللمفاوية الفقارية واتصالاتها اللمفاوية خارج العمود الفقري. إثبات امتصاص التتبع من قبل الأوعية اللمفاوية الفقارية والصرف اللمفاوي نحو الجهاز اللمفاوي خارج العمود الفقري.
تنفيذ حقن التتبع بعناية فائقة لعدم الإزعاج التي CSF الدورة الدموية. بروتوكول iDISCO + هو مُني جداً ولكن تحتاج إلى التكيف مع حجم العينات الخاصة بك. بعد حقن التتبع في الجهاز العصبي المركزي يمكن أن يكون التلطيخ المناعي أو تجربة التصوير الحية AUS.
يمكن استخدام بروتوكول iDISCO + لدراسة الخلايا المختلفة، والسكان، والأنسجة.
نظرة عامة
يجمع هذا البروتوكول بين تصفية الأنسجة ومجهر الفلورسنت ذي الورقة الضوئية (LSFM) لتصوير الأوعية اللمفاوية والعقد اللمفاوية في ثلاثة أبعاد. وهو يتيح تصويراً تفصيلياً لنظام التصريف اللمفاوي المرتبط بالسائل الدماغي النخاعي والسائل فوق الجافية الشوكي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم المناعة
- تقنيات المجهر
خلفية علمية
- يُعد فهم التصريف اللمفاوي أمراً بالغ الأهمية لدراسة الاستجابات المناعية.
- قد لا توفر طرق التصوير التقليدية تفاصيل كافية للهياكل اللمفاوية.
- تستخدم هذه الدراسة تقنيات تصوير متقدمة للتغلب على هذه القيود.
- يحافظ بروتوكول iDISCO+ على سلامة الأنسجة من أجل التحديد الدقيق لمواقع الخلايا.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لتصوير الأوعية اللمفاوية الفقرية والعقد اللمفاوية التي تصب فيها.
- تسهيل دراسة الحركة اللمفاوية للخلايا المناعية.
- تعزيز فهم دور الجهاز اللمفاوي في حالتي الصحة والمرض.
الطرق المستخدمة
- بروتوكول iDISCO+ لإزالة العتامة من أجل تحضير الأنسجة.
- المجهر الفلوري ذو الصفحة الضوئية للتصوير.
- حقن المقتفي الفلوري في الأم الجافية.
- خطوات التجفيف وإعادة الترطيب المتتابعة لمعالجة العينات.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح للأوعية والعقد اللمفاوية ثلاثي الأبعاد.
- الحفاظ على السلامة الخلوية طوال عملية التصوير.
- رسم خرائط تفصيلية لحركة الخلايا المناعية في الجهاز اللمفاوي.
- الحصول على صور عالية الدقة باستخدام تقنيات LSFM.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول المدمج أداة قوية لدراسة التراكيب اللمفاوية.
- ويفتح آفاقاً جديدة للأبحاث المتعلقة بديناميكيات الجهاز المناعي.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في دراسات متنوعة تتناول التفاعلات اللمفاوية والمناعية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التصوير ثلاثي الأبعاد للأوعية اللمفاوية الفقارية باستخدام تقنيتي iDISCO+ وLSFM تصوراً غير مسبوق للدوائر اللمفاوية المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي، مما يدعم الحد من المخاطر الميكانيكية في أبحاث الأوعية العصبية والمناعة العصبية. وتعزز هذه القدرة من الثقة التنبؤية في دراسات الاكتشاف المبكر والدراسات الانتقالية التي تستهدف تصريف الفضلات من الجهاز العصبي المركزي، والمراقبة المناعية، وآليات المرض. كما يتموضع هذا النهج بشكل استراتيجي لتوجيه عملية التحقق من الأهداف وتطوير المؤشرات الحيوية في مجموعات أبحاث الأمراض التنكسية العصبية، والأورام، والجهاز العضلي الهيكلي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح رسم خرائط عالية الدقة لمسارات التصريف اللمفاوي ذات الصلة بالتحقق من صحة أهداف الجهاز العصبي المركزي.
- يدعم تقليل المخاطر الآلية من خلال تصور حركة الخلايا المناعية والمواد المتتبعة في الموقع.
- يسهل اختبار الفرضيات المتعلقة بآليات التخلص من النفايات في الجهاز العصبي المركزي وآليات المراقبة المناعية.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر أنظمة تصوير ثلاثية الأبعاد مُصادق عليها للتقييم الكمي لبنية الجهاز اللمفاوي ووظيفته.
- يتيح تصوراً قابلاً للتكرار لامتصاص المقتفي وتصريفه من أجل توحيد معايير المقايسة.
- يدعم تطوير مقايسات تصوير قابلة للتوسع لفحص المركبات أو الأجسام المضادة التي تستهدف المسارات اللمفاوية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يعمل على مواءمة مخرجات التصوير مع النماذج ذات الصلة بالأمراض في مجالي المناعة العصبية والبيولوجيا الوعائية العصبية.
- يتيح الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال تتبع دوائر التصريف الجزيئية والخلوية.
- يدعم قرارات التقدم المعدلة وفقاً للمخاطر للعلاجات والمؤشرات الحيوية التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن المسار الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية من خلال توفير بيانات كمية ذات دقة مكانية حول الشبكات اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي وديناميكيات التصريف.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات الخاصة بوظيفة الجهاز اللمفاوي في الجهاز العصبي المركزي.
- الفحص: يوفر مخرجات تصوير كمية وقابلة للتكرار لضمان جاهزية المقايسة.
- التحليلات: يتيح قياس توزيع المقتفيات وتمركز الخلايا المناعية عبر الظروف التجريبية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط نتائج التصوير بنماذج الأمراض واستراتيجيات المؤشرات الحيوية في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي والفقرات.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لمنصة تصوير قابلة لإعادة الاستخدام في تطبيقات بحثية متنوعة تخص الجهاز العصبي المركزي والجهاز اللمفاوي.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية وتحد من الغموض الآلي في أبحاث الجهاز اللمفاوي للجهاز العصبي المركزي.
- القيمة التشغيلية: توحد سير عمل التصوير ثلاثي الأبعاد لضمان القابلية للتكرار والتوسع عبر الدراسات المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تساهم في اتخاذ قرارات الاستمرار أو التوقف وتحديد أولويات المحفظة لبرامج الجهاز العصبي المركزي وعلم المناعة.
- تأثير المحفظة: تتيح التقدم المعدل وفقاً للمخاطر وتكامل البيانات عبر الوظائف المختلفة في مراحل البحث والتطوير المبكرة والترجمية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في عمليات تصفية الأنسجة، والوسم المناعي، والمجهرية المتقدمة.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة LSFM والبرمجيات التحليلية المتوافقة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد.
- يتطلب توحيد معايير تحضير العينات وبروتوكولات التصوير بين الفرق المختلفة.
- قد يلزم إجراء تعديلات لتناسب أحجام الأنسجة أو الأنواع المختلفة.
- تعد سلامة العينة ودقة حقن المقتفي أمرين حاسمين للحصول على نتائج موثوقة.
الأسئلة الشائعة حول الصيدلة الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Intra-Cisterna Magna (ICM) and Thoracolumbar (ThLb) Injection
2:22
Perfusion and Tissue Dissection
3:34
Whole Mount Vertebral Segment Immunolabeling-Enabled Imaging of Solvent-Cleared Organs-Plus (iDISCO+)
6:14
Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM) Imaging
8:02
Results: Representative Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage
9:21
Conclusion
