نموذج من مرض القلب الإقفاري والمقارنة المستندة إلى الفيديو من انكماش القلبية من خلال استخدام هابسك المشتقة من القلب
مايو 5, 2020
نقدم نموذجًا لأمراض القلب الإقفارية باستخدام خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان، إلى جانب طريقة للتقييم الكمي لتلف الأنسجة الناجم عن نقص التروية. يمكن أن يوفر هذا النموذج منصة مفيدة لفحص المخدرات والمزيد من البحوث حول أمراض القلب الإقفارية.
غالباً ما يتم إجراء أبحاث أمراض القلب في الثدييات الصغيرة مثل القوارض. ومع ذلك ، فإن فسيولوجيا قلب الإنسان تختلف اختلافا كبيرا عن قلب القوارض. يستخدم بروتوكولنا cardiomyocytes متمايزة عن خلايا iPS البشرية لنموذج مرض القلب الإقفاري وتحديد الضرر والإعاقة الوظيفية للقلب الإقفاري.
قد يوفر هذا البروتوكول طريقة مريحة لفحص الأدوية الشخصية باستخدام خلايا iPS المستمدة من المرضى الفرديين ، والتعامل المناسب مع خلايا iPS ، مثل استخدام الوسيط الطازج ، وتغيير الوسط ببطء وفي الوقت المحدد أمر بالغ الأهمية لضمان التمايز الناجح إلى خلايا القلب الوظيفية. ومن بين الاجراءات التى ستثبت ذلك مع يون ليو ويين ليانغ و منغشيو وانغ سوف يكون تشن وانغ طالب دكتوراه من معمل . للحث على تمايز الخلايا الجذعية المتعددة القدرة البشرية في خلايا القلب ، اغطي أولاً آبار لوحة ثقافة 96 بئرًا مع 100 ميكرولتر من 1.675 ميكروغرام لكل ملليلتر من اللامينين في PBS.
بعد حضانة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، انظر ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الجذعية الرابعة في 200 ميكرولترات من االتيمتر من صيانة IPS المتوسطة تكمل مع 10 ميكرومولار Y27632 في كل بئر، وإعادة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية. بعد 24 ساعة، استبدال وسائل السوبر مع 200 ميكرولترات من متوسطة النمو IPS في بئر، والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام إضافية. عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ التقاء.
استبدل الوسيط في كل بئر بـ 200 ميكرولترات من التمايز المدفأ مسبقًا A وإعادة اللوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة أخرى. في نهاية الحضانة ببطء استبدال السوبر في كل بئر مع 200 ميكرولترات من التمايز قبل الدافئة B وإعادة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية. بعد يومين، استبدال supernatants مع 200 microliters من قبل تدفئة القلب والدفء صيانة المتوسطة في البئر وعاد لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة تصل إلى 30 يوما.
لتقييم قابلية القلب، تثبيت الصورة الجسيمات velocimetry الصورة ي البرنامج المساعد واستخدام المجهر النقيض مرحلة والهدف الشوك لتسجيل صور الفيديو من الخلايا في حوالي 20 لقطة في الثانية لمدة 10 ثانية تقريبا. ثم حفظ ملف الفيديو كما حلل API لدينا وإنشاء هيكل مجلد كما هو مبين. لتحليل منفصلة حقول ناقلات ثنائي الأبعاد من النزوح الخلوية، وإطلاق VG وتحديد الإضافات، وحدات الماكرو وتحرير لفتح تحليل ناقلات.
ijm، ثم انقر فوق تشغيل سيتم تنفيذ التحليل تلقائيا. لعلاج الإقفاري، استبدال عظمى في كل بئر مع 200 ميكرولتر من دميم دون الجلوكوز والمصل، ثم وضع لوحة في غرفة نقص الأكسجة ثم ضخ غاز النيتروجين في الغرفة، والحفاظ على تركيز الأكسجين الداخلي في 2٪، وتركيز ثاني أكسيد الكربون في 5٪ لمدة 24 ساعة. الخلايا المتمايزة بنجاح، يوضح تقلص عفوي كما لوحظ تحت المجهر مع 50٪ من الآبار الثقافة عادة ما تظهر انكماش عفوية في أقل من 20 يوما.
يمكن أيضا أن تستخدم بروتين علامة القلب لتأكيد التمايز الناجح الخلايا من مجموعة الإقفاري عادة ما يحمل قابلية أقل في MTT المقايسات, وأقل قابلية من تلك من مجموعة التحكم في علم القاعدة. نسبة الخلايا الإيجابية الايوديوم يوديد هو أيضا أعلى في المجموعة الإقفاري، مما كانت عليه في مجموعة التحكم، مما يدل على حدوث أعلى من تلف الخلوية. من المهم أن تقوم بتحديد مواقع المناطق التي تهم لوحة الالتقاط بدقة للسماح بالمقارنة بين قابلية عضلة القلب.
يمكن استخدام هذه التقنية لفحص المخدرات ، وذلك باستخدام الخلايا iPS المستمدة من المريض. كما يوفر منصة فريدة من نوعها لزيادة توضيح الآليات الكامنة تحت أمراض القلب الإقفاري
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لنمذجة مرض نقص تروية القلب باستخدام الخلايا العضلية القلبية المتمايزة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (hiPS-CMs). وتتيح هذه الطريقة قياس التلف الخلوي والضعف الوظيفي في ظل ظروف نقص التروية، مما يوفر منصة ذات صلة سريرياً لأبحاث أمراض القلب وفحص الأدوية المخصص.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- أبحاث القلب والأوعية الدموية
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- الفسيولوجيا الخلوية
خلفية علمية
- يُعد مرض نقص تروية القلب أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم.
- تُستخدم نماذج القوارض بشكل شائع، إلا أنها تختلف اختلافاً كبيراً عن فسيولوجيا القلب البشرية.
- توفر الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPS) نموذجاً أكثر ملاءمة لدراسة أمراض القلب البشرية.
- هناك حاجة إلى منصات تسهل كلاً من نمذجة الأمراض وفحص الأدوية في سياق بشري.
الغرض من الدراسة
- تحديد بروتوكول لتمايز الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPS cells) إلى خلايا عضلية قلبية.
- نمذجة مرض نقص تروية القلب في المختبر باستخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (hiPS-CMs).
- قياس الضرر الخلوي والضعف الوظيفي تحت ظروف نقص التروية.
الطرق المستخدمة
- تمايز الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPS cells) إلى خلايا عضلية قلبية باستخدام أوساط زراعية متسلسلة وأطباق مطلية باللامينين.
- حث نقص التروية عن طريق تعريض الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة (hiPS-CMs) لأكسجين بنسبة 2% ووسط خالٍ من الغلوكوز والمصل لمدة 24 ساعة في غرفة نقص أكسجة.
- تقييم حيوية الخلايا باستخدام مقايسات MTT وصبغة يوديد البروبيديوم.
- قياس القدرة على الانقباض عبر تحليل مجال متجه الإزاحة باستخدام مجهر تباين الأطوار وبرنامج قياس سرعة الصور الجسيمية.
النتائج الرئيسية
- أدت الظروف الإقفارية إلى زيادة نسبة الخلايا المصابة، كما يتضح من زيادة صبغ يوديد البروبيديوم.
- انخفضت حيوية الخلايا في المجموعة الإقفارية مقارنة بمجموعات الضبط.
- قلّت قدرة خلايا hiPS-CMs على الانقباض في ظل الظروف الإقفارية.
- أظهرت ما يقرب من 50% من آبار المزرعة انقباضًا تلقائيًا خلال 20 يومًا من التمايز.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول نموذجاً قوياً في المختبر لمرض نقص تروية القلب باستخدام خلايا عضلة القلب المشتقة من البشر.
- يتيح هذا النظام قياس كل من التلف الخلوي والضعف الوظيفي.
- يعد هذا النموذج مناسباً للفحص الشخصي للعقاقير والدراسات الميكانيكية الإضافية لمرض نقص تروية القلب.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
تعالج نماذج الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) الفجوة الترجمية بين الدراسات التي تُجرى على القوارض وأمراض القلب البشرية، مما يتيح اكتشافات أكثر دقة وتنبؤية في المراحل المبكرة من علاج مرض القلب الإقفاري. كما توفر تحليلات الانقباض الكمية القائمة على الفيديو ومقاييس الحيوية بيانات قابلة للتطبيق للتحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية. وتدعم هذه المنصة قرارات المحفظة الدوائية المعدلة حسب المخاطر واستراتيجيات فحص الأدوية المخصصة في مجال البحث والتطوير للأمراض القلبية الوعائية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يُمكّن من استقصاء آليات الإصابة بنقص التروية في نظام يحاكي الحالة البشرية.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال قراءات كمية للقدرة الانقباضية والحيوية.
- يسهل تقليل المخاطر الميكانيكية عبر نمذجة الاستجابات الخلوية ذات الصلة بالمرض.
- يعزز الثقة التنبؤية لعمليات الفرز المبكر للملفات في البرامج القلبية الوعائية.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر منصة موحدة من الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (hiPSC-cardiomyocyte) لتقييم المركبات بشكل قابل للتكرار.
- يقدم مقاييس كمية للانقباضية عبر تحليل مجال متجه الإزاحة.
- يتيح إجراء مسح قابل للتوسع يعتمد على الفيديو للكشف عن القصور الوظيفي في ظروف نقص التروية.
- يدعم جاهزية المقايسة لعمليات مسح الأدوية اللاحقة والدراسات الميكانيكية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط النتائج المخبرية ببيولوجيا الأمراض البشرية لضمان الاستمرارية الانتقالية.
- يسمح باستخدام الخلايا المشتقة من المرضى لتحديد ملامح الاستجابة الدوائية المخصصة.
- يقلل الاعتماد على النماذج غير البشرية، مما يعزز الصلة المرضية للبيانات قبل السريرية.
- يدعم اكتشاف المؤشرات الحيوية والتحقق من صحتها في سياق ذي صلة سريرياً.
تكامل سير العمل ومسارات المعالجة
يربط نموذج نقص تروية الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (hiPSC-cardiomyocyte ischemia model) بين مراحل الاكتشاف المبكر وتحديد المركبات الواعدة والأبحاث الانتقالية، وذلك من خلال توفير نقاط نهاية وظيفية ومؤشرات حيوية خاصة بالبشر.
- بيولوجيا الاكتشاف: تكميم الإصابة الإسكيمية والخلل الوظيفي الانقباضي لاختبار الفرضيات وتحليل المسارات.
- الفحص: توفير مخرجات كمية وقابلة للتكرار للانقباضية والحيوية لفرز المركبات.
- التحليلات: دمج تحليل الإزاحة القائم على الفيديو ومقايسات الحيوية لإجراء مقارنات إحصائية قوية.
- الأبحاث الانتقالية: تمكين النمذجة الخاصة بالمرضى ودعم مواءمة المؤشرات الحيوية مع النهايات السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: إنشاء منصة قابلة للتطوير وإعادة الاستخدام لاكتشاف أدوية القلب والأوعية الدموية والدراسات الميكانيكية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الهدف.
- القيمة التشغيلية: توحد المقايسات الوظيفية وتدعم سير العمل القابل للتوسع والتكرار.
- القيمة الاستراتيجية: تساهم في اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف وتعزز كفاءة رأس المال من خلال تقليل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بالأصول الخاصة بأمراض القلب والأوعية الدموية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من البشر (hiPSC)، وتمايزها، والتحقق من المؤشرات القلبية.
- يتطلب الوصول إلى غرف نقص الأكسجين، والمجهر بتباين الطور، وبرمجيات تحليل الفيديو.
- يستدعي توحيد المعايير بين الفرق لضمان تكرار المقايسة وقابلية مقارنة البيانات.
- قد يكون التكييف ضرورياً لمختلف خطوط الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من المرضى أو الأنواع الفرعية للأمراض.
- يعد الاختيار الدقيق لمنطقة الاهتمام أمراً بالغ الأهمية لإجراء مقارنة دقيقة للانقباضية.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Cardiac Differentiation Induction
2:30
Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte (iPS-CM) Contractility Assessment
3:15
Ischemia Exposure
3:42
Results: Representative Cardiac Cell Differentiation
4:27
Conclusion
