طريقة عالية الإنتاجية لقياس وقت تقس الكحول من الكلينوفيلا الفردية

Drosophila يوفر نموذجا ممتازا لدراسة الأسس الوراثية للحساسية الكحول لأنه يمكنك تحديد حساسية الكحول بدقة تحت الخلفيات الوراثية التي تسيطر عليها والظروف البيئية. الأساليب الحالية لقياس حساسية الكحول في مجموعات اختبار دروسوفيليا من الذباب. نقدم طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية لتقييم حساسية الكحول في أعداد كبيرة من الذباب الواحد.

يمكن ترجمة الاختلاف في حساسية الكحول في دروسوفيليا إلى أنماط ظاهرية مماثلة في البشر لأن الذباب يشترك في حوالي 75٪ من جيناتهم مع تقويم البشر. ويمكن أيضا تطبيق التعقيس الذي طورناه لقياس آثار السمية الحادة للمتطايرات على الحشرات الأخرى، بما في ذلك أنواع الذباب الأخرى أو ناقلات الأمراض. تبدأ من خلال إنشاء قالب من الورق المقوى من لوحة ثقافة خلية 24-well.

تتبع حول لوحة، وقطع المنطقة المعينة. ثم استخدم قالب الورق المقوى لإنشاء قطعة من شبكة صغيرة من شاشة الحشرات بحجم اللوحة. وضع خط صغير من الغراء الساخن حول محيط لوحة ثقافة 24-well، ولصق شبكة الشاشة على رأس الآبار.

ثم استخدام بندقية الغراء الساخن لتأمين عصا حرفة خشبية إلى ثلاثة جوانب من لوحة الثقافة. إعداد العديد من لوحات كما يمكن أن يصلح في غرفة التصوير. لإنشاء غرفة التصوير، قطع ثقب في حجم عدسة كاميرا الفيديو على جانب واحد من مربع البوليسترين ومشق إضافي على حجم لوحة الإضاءة على الجانب الآخر.

أدخل لوحة الإضاءة في الشق، ووضع الكاميرا في فتحة العدسة فوق لوحة الإضاءة. ضع جميع مواد الاختبار في بيئة خاضعة للرقابة، ويفضل أن تكون غرفة سلوكية مع رطوبة 30٪ تقريبًا، ودرجة حرارة 25 درجة مئوية، وتدفق هواء موحد، ومستويات ضوضاء أقل من 65 ديسيبل. استخدام قالب من الورق المقوى التي تم صنعها سابقا لقطع قطعتين من قماش الجبن.

ثم ماص واحد ملليلتر من 100٪ الإيثانول من خلال شبكة الشاشة في كل بئر. جفف الشبكة، وضع قطعتين من قماش الجبن على القمة. قطع قطعة صغيرة من رقيقة، مرنة، لوحة القطع البلاستيكية باستخدام قالب من الورق المقوى كدليل لتوسيع المنطقة بمقدار واحد إلى اثنين سم على أحد الجانبين القصير.

بعد قطع، وضمان أن البلاستيك لا يزال يناسب بين ثلاثة خشبية الحرف العصي على جهاز الاختبار ولكن معلقة قبالة نهاية واحدة. إعداد الطامح وفقا لاتجاهات المخطوطات، واستخدامها لنقل ذبابة واحدة في بئر إلى لوحة ثقافة 24 جيدا خلية، وتغطي أي آبار مع ذباب يستنشق سابقا مع البلاستيك مرنة. سجل موقع جيد وأية معلومات ذات صلة من النمط الجيني أو النمط الظاهري لكل ذبابة.

عقد تدفق البلاستيك مرنة مع الجزء العلوي من لوحة ثقافة الخلية التي تحتوي على الذباب، وعكس لوحة على الجزء العلوي من لوحة ثقافة الخلية المعدلة مع الإيثانول. استخدام الحرف العصي لمحاذاة لوحة ثقافة الخلية المقلوبة، والتأكد من أن كل بئر مع الإيثانول محاذاة مع كل بئر تحتوي على ذبابة. تأكد من إضاءة لوحة الإضاءة بسطوع كامل، وابدأ التسجيل باستخدام كاميرا الفيديو.

عرض الذباب إلى الإيثانول عن طريق إزالة البلاستيك بعناية بين الطبقتين ، مع التأكد من عدم طرد قماش الجبن. عندما يشتبه في أن جميع الذباب قد فقدت السيطرة على الوضعية، اضغط بقوة في وسط لوحة. إذا كان هناك حركة، استمر في التسجيل، ثم النقر فوق كل دقيقة إلى دقيقتين حتى لا يحدث أي حركة.

إنهاء التسجيل بمجرد عدم وجود حركة. لاستعادة الذباب، وإزالة لوحة العلوي من جهاز الاختبار، وpirate الذباب الفردية في حاويات مختارة. استبدال الإيثانول في لوحات ثقافة الخلية المعدلة مرة واحدة على الأقل في الساعة للحفاظ على التعرض الإيثانول متسقة في جميع أنحاء المقايسة، وتكرار التجربة لأكبر عدد من العينات حسب الرغبة.

مشاهدة تسجيل الفيديو لتحديد وقت التخديم الطيران، والذي يعرف بأنه لحظة الذبابة يفقد السيطرة الوضعية والقدرة الحركي. لضمان الدقة، شاهد الفيلم في الاتجاه المعاكس، وسجل الوقت الذي تبدأ فيه الذبابة في التحرك. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد بيانات عن عدد كبير من الذباب في غضون 10 دقائق.

تم استخدام اثنين من لوحات 24-جيدا لقياس وقت واحد أوقات تخدير الإيثانول ل 48 الذباب الفردية من خطين DGRP مع حساسيات مختلفة للكحول. أحجام العينات الكبيرة تزيد من الدقة وتخفض الخطأ إلى التباين البيئي. RAL_555 الذباب كانت أقل حساسية من RAL-177 الذباب.

ولم يظهر تأثير RAL_177 الذكور والإناث، في حين أن الإناث من RAL_555 الخط أقل حساسية للتعرض الإيثانول من الذكور. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم جداً تنفيذ طموح الذباب وانعكاس لوحة ثقافة الخلية بدقة لتحقيق النتيجة المرجوة. منذ القدرة على تقييم الذباب واحد يتجنب آثار محيرة بسبب التفاعلات الجماعية، وهذا الفحص يعزز فائدة نموذج Drosophila للدراسات عالية الإنتاجية على الآثار الحادة للتعرض للكحول.